上海交通大学医学院邓刘福组 | 肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法
学术
科学
2024-12-01 09:02
中国
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Bio-101 是 Bio-protocol 旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将与大家分享其中的文章，本次是上海交通大学医学院邓刘福团队的题为“肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法“的方法文章。
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树突状细胞是一群功能强大的抗原提呈细胞，是联系固有免疫和特异性免疫的中坚力量。cDC表达CD11c和MHCII，可分为cDC1和cDC2两个不同的亚群 (Guilliams等，2014)。cDC1s分化依赖于转录因子BATF3，IRF8和ID2，表达趋化因子受体XCR1；在小鼠肿瘤模型中，一般加用整合素αE分子 (CD103) 来标记 (Salmon等，2016)。而cDC2s的分化依赖于转录因子RELB，IRF4和ZEB2，表面表达CD11b和CD172a分子可使其与cDC1s亚群区分开。cDC1s主要执行交叉提呈肿瘤抗原，激发CD8+T细胞杀伤效应，已被广泛研究证实是肿瘤排异反应及肿瘤免疫治疗的关键亚群 (Bottcher等，2018)。本文阐述如何运用流式技术检测肿瘤微环境内DC亚群及其成熟标志，为相关研究作铺垫。关键词：树突状细胞 肿瘤微环境 流式技术
3. 6孔细胞培养平底板 (NEST®, catalog number: 032819AA01)4. 96孔细胞培养U底板 (NEST®, catalog number: 112518AA03)5. 15 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339650)6. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339652)7. 无菌注射器 (上海康德莱企业发展有限公司，KDL®)8. 70 μm孔径滤网 (Corning, Falcon®, catalog number: 352350)9. 5 ml无菌圆底管 (带滤网) (Corning, Falcon®, catalog number: 352235)1. 胎牛血清 (Gemini, FoundationTM, catalog number: 900-108)2. Anti-FcR (CD16/CD32) 抗体 (BioXCel, catalog number: BE0307)3. 胶原蛋白酶I (Worthington Biochemical®, catalog number: LS004186，-20°C储存)4. 脱氧核糖核酸酶I，来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich®, catalog number: DN25，-20°C储存) 5. DMEM基础高糖培养液 (HycloneTM, catalog number: SH30243.01)6. PBS (HycloneTM, catalog number: SH302560.31)1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307)2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience, BD, catalog number: 565388)3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend, catalog number: 109839)4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend, catalog number: 128035)5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend, catalog number: 127643)6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend, catalog number: 101216)7. Anti-mouse-CD11c-APC (Biolegend, catalog number: 117310)8. Anti-mouse-CD103-APC/Cy7 (Biolegend, catalog number: 121432)9. Anti-mouse-F4/80-BV421 (Biolegend, catalog number: 123137)10. Anti-mouse-CD86-FITC (Biolegend, catalog number: 105005)11. Anti-mouse-MHC class II (I-A/I/E)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend, catalog number: 107625)1. 37 °C二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific)2. 电热恒温水槽 (上海一恒科学仪器有限公司，model：DK-8AXX)3. 低温离心机 (Eppendorf®, model: 5810R)4. 微型台式真空泵GL-802B型 (Kylin-bell®, model: GL-802B型)5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent)1.1分组标记：根据实验分组需求取若干六孔板，标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入3 ml DMEM高糖培养基，将六孔板置于冰上待用。1.2配制肿瘤组织消化液：将预先配制的100× 消化液母液 (含100 mg/ml胶原酶I和20 mg/ml DNA酶I) 用含5% FBS的DMEM高糖培养基稀释100倍，即最终工作浓度为1 mg/ml胶原酶I和200 μg/ml DNA酶I。将1× 消化液置于37 °C水浴锅预热待用。1.3器械准备：根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子，用双蒸水洗净后75%乙醇消毒，烘干备用。采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，喷洒75%乙醇消毒。左手持弯镊，右手持剪刀在肿瘤右侧1 cm处沿肿瘤边缘剪开一长约2 cm口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折，可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开，将肿瘤剥离，注意肿瘤若有溃烂，则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。待全部肿瘤剥离完毕，用移液枪吸出预留DMEM高糖培养基，余大约0.1 ml，以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织，将肿瘤组织剪成泥浆状，肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。将肿瘤组织剪成泥浆状后，每孔加入2 ml 1× 消化液，用1 ml枪头将肿瘤组织碎末打散，置于37 °C恒温细胞培养箱消化30 min，每隔10 min将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化，以免影响免疫细胞活性。可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。消化完毕后，将六孔板取出放于冰板上，每孔加入4 ml DMEM高糖培养基 (含5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至70 μm细胞滤网过滤，同时用1 ml注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 (注意研磨时切勿用力，易将脂肪等带入细胞悬液中)，用DMEM高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块，所得肿瘤悬液4 °C，850 x g，离心5 min。由于髓系细胞表面表达较多Fc受体，容易对流式抗体有非特异性结合，故采用预先阻断Fc受体封闭。离心后弃上清，根据沉淀多少加入适量FACS缓冲液混匀，取10 μl细胞悬液计数，将悬液细胞密度调至2 × 107个/ml。取100 μl细胞悬液于U底96孔内，按100:3比例加入抗Fc受体抗体 (即每100 μl细胞悬液加入3 μl抗Fc受体抗体)，4 °C孵育30 min。按照表1配制流式抗体混合液 (用FACS缓冲液配制)，每孔加入70 μl流式抗体混合液，根据需要计算每个流式抗体所需体积。注：由于F4/80、MHCII、CD11c、CD86染色均显示漂移，没有明显分群，需要额外增加空白对照 (不加相应的流式抗体) 和荧光扣除对照 (加入与相应流式抗体一样的只带荧光的流式抗体)。以anti-mouse-CD11c-APC为例，空白对照即不加CD11c-APC这支流式抗体，而荧光扣除对照则是添加anti-rat-IgG-APC。![]()
表1. 肿瘤微环境内MDSCs流式染色配色
注：流式抗体使用配色可自行调整，注意不要使用补偿过大的荧光通道。另外，MC38皮下瘤模型中DC基本为DC2，未见CD103+DC1。封闭结束后，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清，每孔加入70 μl流式抗体混合液，轻柔吹打混匀，注意不要有气泡。将96孔板置于4 °C避光，染色30 min。染色结束后每孔加入200 μl FACS缓冲液，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清后再次加入200 μl FACS缓冲液洗涤一次，4 °C 850 x g离心5 min。弃上清，加入300 μl FACS缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至带滤网的流式管中 (同时过滤细胞悬液)。制备好的流式染色样品用BD Fortessa进行分析，数据处理软件采用FlowJo Version 10.0。设门方式 (图1)：
DC2：Single cell, live, CD45+Ly6C-Ly6G-CD11c+MHCII+F4/80-CD11b+
成熟标志：CD80，CD86
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图1. 肿瘤内DC的设门方式
DMEM基础高糖培养液 + 5%胎牛血清4 °C冷藏，1个月内使用5%DMEM培养液 + 胶原蛋白酶I (工作浓度：1 mg/ml) + 脱氧核糖核酸酶I (工作浓度：200 μg/ml)1. Bottcher, J. P., Bonavita, E., Chakravarty, P., Blees, H., Cabeza-Cabrerizo, M., Sammicheli, S., Rogers, N. C., Sahai, E., Zelenay, S. and Reis e Sousa, C. (2018). NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting Cancer Immune Control. Cell 172(5): 1022-1037 e1014.2. Guilliams, M., Ginhoux, F., Jakubzick, C., Naik, S. H., Onai, N., Schraml, B. U., Segura, E., Tussiwand, R. and Yona, S. (2014). Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nat Rev Immunol 14(8): 571-578.3. Salmon, H., Idoyaga, J., Rahman, A., Leboeuf, M., Remark, R., Jordan, S., Casanova-Acebes, M., Khudoynazarova, M., Agudo, J., Tung, N., Chakarov, S., Rivera, C., Hogstad, B., Bosenberg, M., Hashimoto, D., Gnjatic, S., Bhardwaj, N., Palucka, A. K., Brown, B. D., Brody, J., Ginhoux, F. and Merad, M. (2016). Expansion and activation of CD103+ dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.Immunity 44(4): 924-938.杨超, 金静思, 邓刘福. (2019). 肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法. Bio-101: e1010310. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010310.
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