上海交通大学杨选明组 | T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法)
学术
科学
2024-12-08 09:00
北京
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Bio-101 是 Bio-protocol 旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将与大家分享其中的文章，本次是上海交通大学生命科学技术学院杨选明团队的题为“T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法)“的方法文章。
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Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯) 染色法，是一种检测细胞分裂的方法。CFSE能够轻易穿透细胞膜，被细胞内的酯酶除去醋酸酯组分后产生荧光，而未进入细胞的CFSE无荧光 (Quah等，2007)。荧光态的CFSE与细胞内的氨基共价结合，偶联到蛋白上，伴随细胞分裂过程，平均分配到子代细胞中，子代细胞荧光强度减少一半。荧光强度随子代细胞分裂而递减，通过流式细胞技术，能够检测荧光强度递减产生的不同荧光强度的峰，可以监测细胞分裂状态，检测细胞增殖情况 (Fulcher和Wong，1999)。以体外OTII多肽刺激小鼠脾脏细胞为例，用CFSE标记脾脏细胞，添加刺激T细胞的OTII多肽，体外培养脾脏细胞，刺激其中的T细胞使其增殖，流式细胞技术检测T细胞增殖情况。通过选取不同时间节点检测T细胞分裂状态，验证OTII多肽对T细胞增殖的影响。关键词：CFSE稀释法 T细胞增殖 流式细胞技术
1. Cell strainer 70 μm (Falcon, catalog number: 352350) 2. 96孔细胞培养板 (Jet Biofil, catalog number: 011096) 3. 35 mm细胞培养皿 (Corning, catalog number: 430165) 4. 离心管 (15 ml, 50 ml) (Jet Biofil, catalog number: CFT011150, CFT011550) 5. 移液管 (5 ml, 10 ml) (Jet Biofil, catalog number: GSP010005, GSP010010) 6. 1 ml 注射器 (上海康德莱企业发展集团股份有限公司) 7. TCR转基因OTII小鼠 (Jackson Lab) 8. Anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301) 9. APC anti-mouse CD3ε (BioLegend, catalog number: 100312) 10. FBS (Gibco, catalog number: 10270) 11. OTII (上海强耀生物科技有限公司合成) 12. IL-2 (北京四环生物制药有限公司, catalog number: 国药准字S10970018) 13. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01) 14. RPMI-1640 (Hyclone, catalog number: SH30809.01) 15. Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010) 16. L-Glutamine (Amresco, catalog number: 0374) 17. β-ME (Amresco, catalog number: 0482) 18. CFSE (Invitrogen, catalog number: C1157) 19. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 101871790) 20. 10× Lysing buffer (BD Bioscience, catalog number: 555899) 21. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g) 22. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g) 23. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g) 24. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g) 25. NaN3 (Amresco, catalog number: 0639-250g) 29. 1× lysing buffer (见溶液配方) 30. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方) 32. Stain mixture (见溶液配方)1. 离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810)2. Vortex振荡器 (Kylin-bell)3. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S)5. 高压灭菌锅 (Boxun, model: YXQ-LS-100S11)1. 断颈处死小鼠，用70%酒精消毒处理，取出小鼠脾脏，置于70 μm cell strainer上；2. 将装有脾脏的cell strainer置于35 mm的细胞培养皿中，然后加入4 ml的完全培养基，使用平底的1 ml注射器进行脾脏研磨；3. 研磨释放脾脏细胞，将脾脏细胞悬液放入50 ml 离心管，再次加入4 ml RPMI完全培养基，冲洗cell strainer，细胞悬液同样放入50 ml 离心管；5. 红细胞裂解，加入2 ml 1× lysing buffer，室温放置2 min.注：若脾脏较小，可选择用1 ml 1× lysing buffer，或裂解红细胞1 min。6. 加入20 ml 1× PBS，中和裂解液，450 x g离心5 min，弃去上清；8. 按照所需要的细胞总量进行细胞重悬：若细胞总数小于5 × 107，离心，1 ml 2% FBS/PBS重悬，放置于15 ml离心管中，若细胞总数大于5 × 107，离心，PBS重悬至5 × 107/ml，放置于15 ml离心管中；9. 用1× PBS稀释CFSE至10 μM (2×)；10. 将等体积的10 μM CFSE加入至待标记的脾脏细胞悬液中，终浓度为5 μM，立即vortex混匀，包上铝箔纸，室温放置7 min；注：若细胞量较少，可以降低CFSE浓度，如终浓度降至2 μM，或者减少标记时间至5 min；11. 加入10 ml RPMI完全培养基，vortex混匀，室温放置2 min，450 x g离心5 min，弃去上清；13. 用含IL-2的RPMI完全培养基重悬脾脏细胞至5 × 106/ml，每孔100 μl加入96孔板，即每孔细胞数为5 × 105，参见视频2；14. OTII多肽刺激，用含IL-2的RPMI完全培养基稀释OTII至20 μg/ml (2×)，每孔100 μl加入96孔板中，终浓度为10 μg/ml，每孔总体积为200 μl，放入细胞培养箱培养；注：设置对照实验，需要同时做：脾脏细胞被CFSE标记且刺激的，即实验组；CFSE标记但不刺激的，用来比较有无刺激T细胞的增殖状况；未标记且刺激的和未标记但不刺激的，用来确定脾脏细胞的荧光本底值，确定阳性范围。15. 分别在第24 h、48 h、72 h、96 h取细胞用于流式检测，加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去上清；16. 加入50 μl anti-CD16/32 (clone 2.4G2) (200 ng/ml)/sample进行Fc受体封闭, 4 °C放置20 min，封闭结束后，加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去上清；17. 准备流式抗体APC anti-mouse CD3ε，按照0.15 μl APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml) + 50 μl FACS buffer/sample稀释抗体；18. 将稀释好的流式抗体加入样品中，50 μl/sample，vortex混匀，4 °C避光放置25 min；19. 加入150 μl/sample FACS buffer，500 x g，离心 3 min，去除上清后，60 μl/sample FACS buffer重悬，进行流式检测，参见视频3。多肽OTII刺激后进行流式分析，先通过FSC-A, SSC-A确定脾脏细胞群 (样品脾脏细胞都表达CD45，可不染CD45，其他样品可进行CD45染色，确定淋巴细胞群)，再画出T细胞群 (即mouse CD3+ 细胞)，选择这群CD3+细胞进行CFSE荧光强度分析 (图1)。
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图1. 流式检测T细胞CFSE荧光强度
未被CFSE标记的脾脏细胞样品，选择CD3+细胞群分析CFSE荧光强度，如图2：
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图2.未标记T细胞CFSE荧光强度
CFSE标记后的脾脏细胞，选择CD3+细胞群分析，左侧图为加入OTII多肽刺激后的流式图，右侧图为无刺激的流式图，从上至下分别为刺激 (左侧) 或培养 (右侧) 24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖情况，如图3所示：
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图3. 流式检测OTII多肽刺激 (左) 与无刺激 (右) T细胞CFSE荧光强度
OTII刺激脾脏细胞24 h时，未见不同荧光强度的峰，只有单一CFSE高强度峰，此时T细胞还未大量增殖；从第48 h起，开始检测到T细胞分裂，出现三个连续荧光强度的峰；第72 h，在之前的基础上出现一个新的荧光强度低一级的峰 (图3红色箭头所示)；第96 h，又一次出现荧光强度低一级的峰 (图3橙色箭头所示)，原始CFSE高强度的峰逐渐消失 (图3绿色箭头所示)，证明T细胞持续分裂与CFSE标记细胞增殖实验的可行性。
对比未加入OTII刺激的脾脏细胞，并没有连续CFSE递减的峰出现，说明在无抗原肽刺激的情况下，T细胞增殖不明显。
1. 进行CFSE标记时，加入CFSE染料一定要均匀，确保每个细胞标记CFSE的强度一致；
2. 尽量使用原代细胞完成实验，培养时间久的细胞再次刺激分裂能力较弱，CFSE标记后出现递减荧光强度峰的数量会减少；3. 当细胞数量少时，用2% FBS/PBS重悬细胞，并降低CFSE工作浓度，缩短标记时间，可以减少CFSE对细胞的损伤，保持细胞分裂能力；4. 若对刚标记完的细胞进行流式检测，会发现CFSE的荧光强度很高但不稳定，18 h后会恢复到稳定的荧光强度；5. 选择与CFSE (FITC) 无补偿的荧光颜色标记CD3，方便流式检测；6. 随着T细胞的活化，mouse CD3信号会减弱，选择T细胞群时，需要根据实际读出的CD3的位置画门，确定T细胞群。Penicillin/Streptomycin 5.5 mlL-glutamine (200 mM) 5.5 ml10× lysing buffer用经过高压蒸汽灭菌后的ddH2O 10倍稀释，即得1× lysing buffer将上述试剂加入800 ml ddH2O依次溶解，待所有试剂完全溶解后，加入ddH2O定容至1 L，高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存待用使用量筒量取100 ml 10× PBS，加入800 ml ddH2O进行稀释，再加入10 ml FBS和2.5 ml NaN3 (20%)，混合均匀后，加入ddH2O定容至1 L，放入4 °C冰箱备用APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml) 0.15 μl按照每个样品50 μl准备stain mixture，50 μl FACS buffer加入0.15 μl流式抗体APC anti-mouse CD3ε (0.2 mg/ml)，混匀备用感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。
1. Fulcher, D. and Wong, S. (1999). Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory. Immunol Cell Biol 77(6): 559-564.2. Quah, B. J., Warren, H. S. and Parish, C. R. (2007). Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc 2(9): 2049-2056.戚馨月, 杨选明. (2019). T细胞增殖的流式检测 (CFSE稀释法). Bio-101: e1010313. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010313.
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