ICIER“制魔器”进展：用Orbitrap测磷酸根氧同位素
文摘
科学
2024-03-30 02:01
江苏
来源：【高维度稳定同位素】公众号（ID：HDStableIsotope）
南京大学国际同位素效应研究中心有个九字发展战略：“固高维，制魔器，入化境”。其中开发Orbitrap自然丰度稳定同位素测试方法是“制魔器”的一部分。相信目前Orbitrap MS（静电场轨道阱质谱仪）对于大多数地学界的同行仍然是一个比较陌生的事物，更不会将其与稳定同位素测试联系在一起，三年前的我也是同样的感受。但实际上Orbitrap技术发展至今已有20多年的历史。由于该技术具有高分辨率、高质量精度及宽动态范围等优点，目前已在蛋白组学、环境检测、食品安全及药物分析等领域得到广泛的应用。2017年，加州理工学院John Elier课题组首次确立了利用Orbitrap测试自然丰度稳定同位素的分析方法，并测试了CO2、Xe气、乙苯等化合物的同位素组成，结果表明该技术的同位素测试内精度可以达到1‰。近两年Orbitrap技术结合电喷雾电离技术（Electrospray Ionization），可以对含氧阴离子和有机小分子的多个同位素体进行同位素测试（以SO42-为例，包括δ34S、δ18O、δ17O、δ33S、δ36S及δ34S18O）。该方法的样品消耗量在ng水平，相比于传统的磁质谱技术的样品消耗量降低了三个数量级。此外，该技术可以直接在溶液条件下对含氧阴离子等的同位素进行测定，省去了传统测试手段所需的复杂前处理流程。那我们为什么优先选择开发Orbitrap测试磷酸根氧同位素的方法呢？迄今为止，最常用的方法是将溶解的磷酸盐沉淀为磷酸银（Ag3PO4）固体，使其在热裂解元素分析仪（TCEA，>1350°C）中，与石墨反应生成一氧化碳（CO），然后利用质谱仪来测量CO的δ18O。然而，磷酸银（Ag3PO4）方法存在一些缺点。首先，该方法需要样品量在4微摩尔或2毫克级别，这使得从磷酸盐含量低的自然介质中提取和纯化Ag3PO4变得繁琐且容易出错。例如，淡水环境中可溶性磷酸盐的浓度通常低于50 μg/L，因此需要收集数百升水样才能获得足够的磷酸盐量进行氧同位素分析。此外，其他化合物（例如硝酸盐和溶解有机化合物）会与Ag3PO4共沉淀，可能影响磷酸盐氧同位素组成的测量。而且，分析自然样品时，Ag3PO4回收的产率容易受到其他离子的影响，从而引起同位素分馏。以上这些缺陷阻碍了磷酸盐的氧同位素的应用。而Orbitrap技术的优势恰好可以解决目前磷酸盐氧同位素测试所面临的问题：1）样品的进样量降低三个数量级，特别是对于环境水样使用新的测试手段只需100 mL就可获得其水中溶解态磷酸根氧同位素值；2）ESI-Orbitrap-MS的液体进样方式可以解决传统Ag3PO4方法回收率不足的问题。PO3- Fragments测试磷酸根氧同位素原理示意图（Wang et al., 2024）那么问题又来了，国际上又不是只有我们一家实验室在尝试用Orbitrap测试稳定同位素，既然Orbitrap在测试磷酸根氧同位素上具有这么大的优势，那么其他人没有想到开发这个方法吗？有！Neubauer et al（2020）提出在Orbitrap质量分辨率设置为120,000的条件下，利用H2PO4-（m/z=97）离子来测量磷酸盐的δ18O，但该方法有效性尚未进行评估。我在理解了Orbitrap测试稳定同位素的技术原理，将ICIER那台Orbitrap Eclipse调教得可以测试同位素后，开始时也是用H2PO4-测试，但是在进行zero-enrichment检测时，总是会有一些点像“幽灵”一样偏离0值，特别是我用USGS80和USGS81标样进行校正后，δ18O的重现性非常差（1SD有5~6‰），这种精度是无法应用到自然丰度的样品测试的。我们当时的猜测是：怪不得Orbitrap测试硫酸根和硝酸根稳定同位素方法两三年前就发表了，怎么磷酸根氧同位素还不见发表？原来坑在这里留着呢。故事的转机出现在2023年1月份，当时疫情刚刚全面放开实验室绝大多数人已经回家过年，我还在实验室守着我那台Orbitrap Eclipse做着最后的挣扎，像往常一样对NaH2PO4溶液进行zero-enrichment检测，想看看增大m/z扫描范围会不会对测试精度有所提高。于是将Orbitrap质量轴的扫描范围增加到50~102m/z，发现在m/z=79的位置上有一个像H2PO4信号强度一样高的峰，我的第一反应是不是仪器出问题了，理论上上机的是纯的NaH2PO4溶液不应该出现含量这么高的一个杂质，于是又测试了硫酸根和高氯酸根溶液，没出现这个现象。我计算后发现m/z=79对应的是PO3-离子，我怀疑是购买的NaH2PO4试剂出了问题。在过年回来后，我用同位素中心的离子色谱对购买的NaH2PO4试剂进行了检测，结果表明试剂没有任何问题，那么就只剩下一种可能就是在电喷雾电离的过程中，一半的H2PO4-转化为PO3-。在查阅了一些资料后我发现这种现象在ESI源的质谱中很常见，被称为In source fragmentation现象，没想到会发生在磷酸根键能这么强的分子上。此时，我内心已经放弃了这个方法的开发，我找到彭永波老师说，你看看，各种碎片都有，它们比例不定，ESI-Orbitrap-MS测试磷酸根氧同位素在技术原理上可能就没法实现。咱们还是放弃吧。脑海里回荡着鲍老师的话：“该放弃时放弃，是一种勇敢”。时间来到了2023年4月份，同样的场景，我又在漫无目的在折腾Orbitrap，发现仪器上有一个source fragmentation的设置还从来没试过（毕竟当时Orbitrap工程师在培训我时说这个功能你们用不上）。我抑制不住内心要试一试的冲动，于是上了NaH2PO4溶液，发现当增大source fragmentation的电压，在质量谱图上PO3-离子信号强度在增加，H2PO4-离子信号强度在降低，当我将source
fragmentation的电压增加到40 V时，几乎所有的H2PO4-离子都转化为了PO3-离子。我突然意识到既然测试H2PO4-离子的δ18O精度很差，那为什么不试试测试PO3-离子呢？说干就干，对PO3-离子zero-enrichment测试结果显示δ18O精度可以达到0.6‰，我们在接下来一个月的时间里对实验中6种NaH2PO4溶液连续测试，在将ESI-Orbitrap-MS测试结果与Ag3PO4测试结果相互校正后，得到该方法的长期测试精度为0.8‰，但样品的消耗量仅为25 nmol。选择PO3-离子测试磷酸根氧同位素的优势不仅仅是这里所描述的，更多的细节就需要大家去阅读我们在线发表在《Analytical Chemistry》的论文了：https://pubs.acs.org/doi/epdf/10.1021/acs.analchem.3c03070。PS：传统磁质谱稳定同位素测试技术发展已达到瓶颈，在近二十年的时间里测试手段并无革命性的发展。稳定同位素的目前测试的天花板MAT 253 Ultra已经使用了很庞大的磁铁，分辨率的极限在50,000，而这仅仅是Orbitrap的起步分辨率。尽管Orbitrap测试稳定同位素技术仍在初步阶段，但其背后的发展潜力给了我们无穷的想象空间。![]()
出品：高维度稳定同位素
编辑：商艳凯
[1]Zhenfei Wang, Shohei Hattori, Yongbo Peng,
Longchen Zhu, Zhao Wei, and Huiming Bao. Analytical Chemistry 2024 96(11), 4369-4376.[2]Cajetan Neubauer, Antoine
Crémière, Xingchen T. Wang, Nivedita Thiagarajan, Alex L. Sessions, Jess F.
Adkins, Nathan F. Dalleska, Alexandra V. Turchyn, Josephine A. Clegg, Annie
Moradian, Michael J. Sweredoski, Spiros D. Garbis, and John M. Eiler. Analytical
Chemistry 2020 92 (4), 3077-3085.本文来源于【高维度稳定同位素】公众号（HDStableIsotope）
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