[1]朱沙沙,马小宏,程莉莉,等.circFOXM1作为新型胃癌标志物调控胃癌发生、发展的机制研究[J].检验医学与临床,2024,21(11):1586-1594.
关键词：环状叉头框蛋白M1; 微小RNA-182-5p; 母亲信号蛋白同源物7; 胃癌; 机制
分析新型胃癌标志物环状叉头框蛋白M1(circFOXM1)在胃癌发生、发展机制中的调控作用。
选取2022年1月至2023年4月该院肿瘤科收治的60例胃癌患者作为研究对象,检测其胃癌组织及癌旁组织中circFOXM1的表达水平。根据circFOXM1的表达水平,将60例患者分为circFOXM1高表达组和circFOXM1低表达组。比较circFOXM1高表达组和circFOXM1低表达组的临床病理资料(淋巴结转移、肿瘤侵袭深度和临床分期)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测GES-1、HGC-27、BGC-823、MKN-45、MKN-1细胞中circFOXM1 信使RNA(mRNA)、微小RNA(miR)-182-5p mRNA与母亲信号蛋白同源物7(SMAD7)mRNA及SMAD7蛋白的表达水平。体外培养MKN-45细胞,将其随机分为对照组、circFOXM1敲低组[转染circFOXM1小干扰RNA(siRNA)质粒]、circFOXM1过表达组(转染circFOXM1过表达质粒)、共转染阴性对照组(转染空载质粒和miR-182-5p 抑制剂阴性对照)、circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组(转染circFOXM1 siRNA质粒和miR-182-5p 抑制剂),分组转染后,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组MKN-45细胞circFOXM1 mRNA、miR-182-5p mRNA与SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白的表达水平;采用Transwell侵袭及细胞划痕试验检测各组MKN-45细胞侵袭迁移情况;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组MKN-45细胞增殖情况。
取50只裸鼠随机分为对照小鼠组、circFOXM1敲低小鼠组、circFOXM1过表达小鼠组、共转染阴性对照小鼠组、circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂小鼠组,每组10只。将各组MKN-45细胞接种在对应裸鼠右腋附近背部皮下构建胃癌移植瘤模型,饲养4周后检测各组移植瘤裸鼠MKN-45细胞增殖率、肿瘤体积及肿瘤质量。将MKN-45细胞随机分为野生miR-182-5p+空载组、野生miR-182-5p+circFOXM1过表达组、突变miR-182-5p+空载组、突变miR-182-5p+circFOXM1过表达组、野生SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组、野生SMAD7+miR-182-5p mimic组、突变SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组、突变SMAD7+miR-182-5p mimic组,再按照不同方式对各组MKN-45细胞进行转染。采用荧光素酶报告试验检测各组MKN-45细胞circFOXM1对miR-182-5p、SMAD7的靶向调控。
circFOXM1低表达组和circFOXM1高表达组病理资料比较：
circFOXM1低表达组有17例患者,circFOXM1高表达组有43例患者。circFOXM1低表达组和circFOXM1高表达组患者淋巴结转移、侵袭深度和临床分期情况比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 circFOXM1低表达组和circFOXM1高表达组病理资料比较[n(%)]
各细胞circFOXM1 mRNA、miR-182-5p mRNA、SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白表达水平比较：
MKN-45、HGC-27、BGC-823、MKN-1细胞中circFOXM1 mRNA、SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白表达水平均高于GES-1细胞,miR-182-5p mRNA表达水平均低于GES-1细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。
图1 各细胞中SMAD7、β-actin蛋白表达
表2 各细胞circFOXM1 mRNA、miR-182-5p mRNA、SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白表达水平比较
注:与GES-1细胞比较,aP<0.05。
不同分组MKN-45细胞circFOXM1 mRNA、miR-182-5p mRNA、SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白表达水平比较：
对照组circFOXM1 mRNA表达水平低于circFOXM1过表达组,高于circFOXM1敲低组和circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组miR-182-5p mRNA 表达水平高于circFOXM1过表达组,低于circFOXM1敲低组,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组SMAD7 mRNA及SMAD7 蛋白表达水平均低于circFOXM1过表达组,高于circFOXM1敲低组,差异均有统计学意义(P<0.05)。circFOXM1敲低组miR-182-5p mRNA 表达水平高于circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组,SMAD7 mRNA及SMAD7 蛋白表达水平均低于circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。
图2 不同分组MKN-45细胞SMAD7、β-actin蛋白表达
表3 不同分组MKN-45细胞circFOXM1 mRNA、miR-182-5p mRNA、SMAD7 mRNA及SMAD7蛋白表达水平比较
注:与对照组比较,aP<0.05;与circFOXM1敲低组比较,bP<0.05。
不同分组MKN-45细胞侵袭及迁移情况比较：
对照组MKN-45细胞侵袭数、迁移率均高于circFOXM1敲低组,均低于circFOXM1过表达组,差异均有统计学意义(P<0.05)。circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组MKN-45细胞侵袭数、迁移率均高于circFOXM1敲低组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、4、表4。
注:A为对照组;B为circFOXM1敲低组;C为circFOXM1过表达组;D为共转染阴性对照组;E为circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组。
图3 不同分组MKN-45细胞侵袭情况(×200)
注:0 h为刚划痕时观察划痕情况;24 h为细胞划痕后继续培养24 h再观察划痕愈合情况;A为对照组;B为circFOXM1敲低组;C为circFOXM1过表达组;D为共转染阴性对照组;E为circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组。
图4 不同分组MKN-45细胞迁移情况(×200)
表4 不同分组MKN-45细胞侵袭数、迁移率比较
注:与对照组比较,aP<0.05;与circFOXM1敲低组比较,bP<0.05。
不同分组MKN-45细胞增殖率、移植瘤裸鼠肿瘤体积及肿瘤质量比较：
circFOXM1敲低小鼠组MKN-45细胞增殖率低于对照小鼠组及circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂小鼠组,肿瘤体积及肿瘤质量均小于对照小鼠组及circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂小鼠组,差异均有统计学意义(P<0.05)。circFOXM1过表达小鼠组MKN-45细胞增殖率高于对照小鼠组、肿瘤体积及肿瘤质量均大于对照小鼠组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表5 不同分组MKN-45细胞增殖率、移植瘤裸鼠肿瘤体积及肿瘤质量比较
续表5 不同分组MKN-45细胞增殖率、移植瘤裸鼠肿瘤体积及肿瘤质量比较
注:与对照小鼠组比较,aP<0.05;与circFOXM1敲低小鼠组比较,bP<0.05。
不同分组细胞相对荧光素酶活性比较：
野生miR-182-5p+空载组(1.01±0.21)、野生miR-182-5p+circFOXM1 过表达组(0.31±0.06)、突变miR-182-5p+空载组(1.00±0.22)、突变miR-182-5p+circFOXM1 过表达组(0.99±0.20)相对荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(F=21.001,P<0.001)。野生miR-182-5p+circFOXM1 过表达组相对荧光素酶活性低于野生miR-182-5p+空载组,差异有统计学意义(t=7.290,P<0.05)。野生SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组(0.98±0.14)、野生SMAD7+miR-182-5p mimic组(0.32±0.05)、突变SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组(1.02±0.20)、突变SMAD7 +miR-182-5p mimic组(1.04±0.26)相对荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(F=22.351,P<0.001)。野生SMAD7+miR-182-5p mimic组相对荧光素酶活性低于野生SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组,差异有统计学意义(t=10.875,P<0.05)。
胃癌的临床治疗主要选择手术切除,同时采用放射线照射、化疗、分子靶向药物等辅助治疗手段,越早治疗,疗效越好,但受限于诊断技术的落后,临床大多数患者为中晚期,治疗效果并不理想,因而需要寻找更高效的诊疗策略。circFOXM1作为调控肿瘤发生及发展的关键调节因子,其表达下调可抑制胶质母细胞瘤增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长,并阻断细胞周期,抑制前列腺癌及肝细胞癌等恶性肿瘤增殖、迁移及侵袭,发挥显著的抗肿瘤功效。本研究结果显示,MKN-45、HGC-27、BGC-823、MKN-1细胞中circFOXM1 mRNA、SMAD7 mRNA、SMAD7蛋白表达水平均高于GES-1细胞,miR-182-5p mRNA表达水平均低于GES-1细胞,差异均有统计学意义(P<0.05);circFOXM1低表达组和circFOXM1高表达组患者淋巴结转移、侵袭深度和临床分期情况比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示相比癌旁组织和GES-1细胞,circFOXM1在胃癌组织及胃癌细胞系HGC-27、BGC-823、MKN-45、MKN-1中的表达水平升高,并与胃癌患者淋巴结转移、侵袭深度和临床分期相关,表明circFOXM1参与介导胃癌发生、发展过程,可作为潜在的新型胃癌标志物。本研究结果显示,circFOXM1敲低组MKN-45细胞侵袭数、迁移率、circFOXM mRNA表达水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);circFOXM1敲低小鼠组MKN-45细胞增殖率低于对照小鼠组,肿瘤体积及肿瘤质量均小于对照小鼠组,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示以circFOXM1 siRNA质粒转染MKN-45细胞,可降低细胞circFOXM1表达水平、侵袭数、迁移率、细胞增殖率、移植瘤裸鼠肿瘤体积及肿瘤质量,circFOXM1 过表达质粒的作用与之相反,表明circFOXM1可诱导胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,敲低其表达可显著抑制胃癌细胞上述生物学行为,最终对胃癌发挥明显抗癌作用。
miR-182-5p作为一种抗肿瘤因子,在胃癌患者体内呈低表达,并参与其病情进展过程,miR-182-5p表达上调可降低胃癌细胞活力,增加凋亡,减弱其对顺铂的耐药性,还可提高肝癌细胞对索拉非尼的细胞毒性并抑制其上皮间充质转化;SMAD7作为一种致癌基因,可调控细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡信号,参与介导肿瘤的发生、发展过程,其在胃癌患者体内呈高表达,并与其临床分期相关,敲除SMAD7可对结直肠癌细胞发挥增殖和抗凋亡作用。荧光素酶报告试验结果显示,野生miR-182-5p+circFOXM1 过表达组相对荧光素酶活性低于野生miR-182-5p+空载组(P<0.05)。野生SMAD7+miR-182-5p mimic组相对荧光素酶活性低于野生SMAD7+miR-182-5p mimic阴性对照组(P<0.05)。提示MKN-45细胞中circFOXM1对miR-182-5p靶向下调,miR-182-5p对SMAD7靶向下调,表明circFOXM1通过调控miR-182-5p/SMAD7轴而介导胃癌的发生、发展过程,miR-182-5p/SMAD7轴参与敲低circFOXM1对胃癌增殖、迁移和侵袭的抑制过程。本研究结果显示,circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂组SMAD7 mRNA及SMAD7 蛋白表达水平、MKN-45细胞侵袭数、迁移率均高于circFOXM1敲低组,miR-182-5p mRNA表达水平均低于circFOXM1敲低组,差异均有统计学意义(P<0.05)。circFOXM1敲低+miR-182-5p 抑制剂小鼠组MKN-45细胞增殖率高于circFOXM1敲低小鼠组,移植瘤裸鼠肿瘤体积及肿瘤质量大于circFOXM1敲低小鼠组,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示与circFOXM1 siRNA质粒单独转染MKN-45细胞相比较,circFOXM1 siRNA质粒联合miR-182-5p 抑制剂转染可升高SMAD7蛋白与SMAD7 mRNA表达水平、MKN-45细胞增殖率、侵袭数、迁移率、移植瘤裸鼠肿瘤体积及质量,降低miR-182-5p mRNA表达水平,提示抑制miR-182-5p表达逆转了敲低circFOXM1对胃癌细胞增殖、侵袭、转移和裸鼠体内生长的抑制作用,最终逆转其对胃癌细胞的抗癌功效,揭示敲低circFOXM1抑制胃癌发生、发展是通过上调miR-182-5p实现的。
综上所述,circFOXM1在胃癌组织及细胞中高表达,与淋巴结转移、肿瘤侵袭深度和临床分期相关,能通过miR-182-5p上调SMAD7表达,从而促使胃癌细胞生长及恶性进展,可作为潜在的新型胃癌标志物。敲低circFOXM1可通过miR-182-5p上调而减少表达SMAD7,在抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的同时降低其于裸鼠体内生长的活性,最终对胃癌起到显著抗癌功效,本文为胃癌的临床诊断和治疗提供了新型作用靶点,有助于其诊疗技术的改进。
（参考文献略）
以上内容有删改，原文《circFOXM1作为新型胃癌标志物调控胃癌发生、发展的机制研究》刊登于《检验医学与临床》2024年21卷11期（点击标题可在线查看原文）
作者：朱沙沙,马小宏△,程莉莉,谢逸尘
作者单位：江苏省如皋市人民医院检验科
说明：本文为《检验医学与临床》原创文章，其他媒体、网站、公众号等如需转载本文，请联系本刊获得授权，并在文题下醒目位置注明“原文刊发于《检验医学与临床》2024年21卷11期”。
编辑：陈晶
审阅：王明丰
