点击蓝字
关注我们
文献来源(引用本文)
LAI Y T, ZHOU J Y, DING P T, et al. Effects of acupuncture at Feishu (BL13) and Tianshu(ST25) on pulmonary function and tissue inflammation in asthma model rats. J Acupunct Tuina Sci, 2023, 21(5): 346-355.
作者信息
来奕恬1, 周竞颖1, 丁攀婷1, 刘密1, 潘江2, 李南2, 张国山1, 邱冉冉2
1 湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，长沙 410208，中国
2 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007，中国
文献摘要
目的: 对比观察肺俞和天枢联用与肺俞单用对哮喘模型大鼠肺功能和组织炎症的影响。
方法: 将48只Sprague-Dawley大鼠随机数字表法分为正常组、模型组、从肺论治组和肺肠同治组, 每组12只。除正常组外，其余三组大鼠采用卵清白蛋白(OVA)致敏和雾化激发的方法制备哮喘模型。模型制备成功后,从肺论治组大鼠针刺双侧肺俞30 min; 肺肠同治组大鼠先后针刺双侧肺俞和天枢各15 min, 共计30 min。每天1次, 连续14 d。其余两组大鼠不干预。干预结束后, 肺功能测定仪测定各组大鼠的肺功能; 光镜下观察苏木素-伊红染色法(HE)染色的肺组织病理学改变、Masson染色的肺组织胶原沉积程度以及瑞-吉染色的肺泡灌洗液( BALF)中炎症细胞的含量; 酶联免疫吸附法检测各组大鼠肺组织中白介素(IL)-4、 IL-5)、IL-13、IL-17、IL-25、IL-33、半胱氨酸白三烯(LT)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和前列腺素D2(PGD2)的含量。
结果: 与正常组相比, 模型组大鼠最大呼气流量(PEF)、动态肺顺应性(Cdyn)、呼出25%肺活量时最大呼气流量(FEF25%)、一秒用力呼气容积占用力肺活量比( FEV1/FVC)、最大呼气中期流量(MMEF)均显著下降(P<0.01或P<0.05), 肺阻力(RL)、胶原沉积程度、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33、LT、TSLP、PGD2及BALF中的中性粒细胞占比显著增加(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比, 从肺论治组大鼠肺功能中FEF25%和FEV1/FVC显著升高(P<0.01, P<0.05), 胶原纤维沉积程度、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、LT、TSLP及PGD2的含量均显著降低(P<0.01或P<0.05); 肺肠同治组大鼠肺功能中PEF、FEF25%及FEV1/FVC均显著升高(P<0.01或P<0.05), RL、胶原纤维沉积程度、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33、LT、TSLP、PGD2及BALF中的中性粒细胞占比显著降低(P<0.01或P<0.05)。与从肺论治组相比, 肺肠同治组大鼠肺组织中IL-5的含量降低(P<0.05)。
结论: 从肺论治及肺肠同治针刺对哮喘模型大鼠肺功能、肺组织炎症及BALF中的炎症细胞均具有良好的改善效果；肺肠同治在改善IL-5含量方面优于从肺论治；肺俞和天枢联用治疗哮喘有优于单用肺俞的趋势。
支气管哮喘(简称“哮喘”)是一种反复发作的，以喘息、痰鸣和气道高反应性为主要症状的，由多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病。现代临床通常使用白三烯受体拮抗剂等药物，以控制并减轻哮喘发作时的症状，维持患者的正常生活水平，预防病情加重，但长效的特效药物仍有待进一步的研发和验证。针灸作为中医传统的外治疗法，不仅可以有效缓解哮喘发作时的症状，而且可以明显降低哮喘发作的频率。基于传统的“肺与大肠相表里”理论，以及现代的“肠-肺轴”理论，在针刺治疗哮喘等肺系疾病时，如若能同时兼顾肠腑的调理，即“肺肠同治”，可有效改善支气管哮喘患者的中医症状，提高患者的肺功能及生活质量。动物实验研究方面，XU N, et al证实针灸肺俞、大椎及风门对哮喘模型大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞及血清白介素(Interleukin，IL)-13等免疫炎症指标具有调整作用；LI L S, et al发现针刺肺俞和肾俞能够抑制哮喘大鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9)的表达，从而减轻哮喘炎症反应。遗憾的是，“肺肠同治”这一诊疗思路在针刺治疗哮喘的临床和动物实验中并未得到广泛的应用。因此，本研究以哮喘模型大鼠为实验对象，以针刺为干预手段，对比观察肺俞和天枢联用与单用肺俞在针刺改善哮喘模型大鼠肺功能及组织炎症中的差异，探讨“肺肠同治”在针刺改善哮喘大鼠肺功能及组织炎症中的意义，为“肺肠同治”在针刺治疗哮喘中的临床应用和推广提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
无特定病原体（Specific-pathogen-free)级Sprague-Dawley大鼠48只，雌雄各半，7周龄，体质量150-170 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。大鼠分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心，饲养温度20-25 ℃，湿度50%-70%。适应性喂养1周后，随机数字表法分为正常组、模型组、从肺论治组和肺肠同治组，每组12只。实验过程中对动物的操作和处理遵守《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。本研究经过湖南中医药大学动物实验中心伦理审批，编号：LL2021032407。
1.2 主要设备与试剂
卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA，货号：A5503)来源于Sigma，美国；氢氧化铝凝胶(货号：77161)来源于Thermo Fisher，中国)；IL-25 (货号：JM-10874R1)、IL-17 (货号：JM-10601R1)、IL-4 (货号：JM-01598R1)、IL-5 (货号：JM-01501R1)、IL-13 (货号：JM-01492R1)、IL-33 (货号：JM-10775R2)、半胱氨酸白三烯(Leukotrienes, LT,货号：JM-11585M1)、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP, 货号：JM-10881R1)及前列腺素D2(Prostaglandin D2，PGD2, 货号：JM-02211R1)酶联免疫吸附试剂盒来源于武汉贝莱茵生物科技公司，中国。
SPECTRAMAX多功能酶标仪(Molecular Devices Corporation，美国)；YP1002小动物电子秤(上海佑科仪表有限公司，中国)；小动物肺功能测定仪(北京拜安吉公司，中国)；自制雾化箱(60 cm× 60 cm × 40 cm)，超声雾化吸入器(海尔公司，中国)。
1.3 模型制备及评价标准
根据参考文献采用OVA致敏并激发的方法制备哮喘大鼠模型。
致敏阶段：分别称取5 g OVA与50 g氢氧化铝凝胶，然后用0.9%的氯化钠溶液配置成容量为500 mL的混合液备用。实验第1天，分别在大鼠双侧背部、腹股沟皮下各注射0.2 mL抗原液，腹腔注射0.8 mL抗原液。实验第9天，再以相同剂量和方法重复致敏。实验第15天开始，除正常组外，将其余各组大鼠放于自制的玻璃雾化缸中，予以1%OVA溶液雾化激发，每次20 min，每天1次，连续1周。
雾化过程中进行观察，若大鼠出现挠鼻、抓面、烦躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、口唇发绀等表现，提示造模成功。
1.4 干预方法
造模成功后，每天将模型组大鼠固定于鼠板上30 min；将从肺论治组大鼠固定于鼠板上，取双侧肺俞，腧穴局部用75%的酒精消毒后，将华佗牌30号1寸不锈钢毫针刺入3-5 mm，捻转20 s后留针15 min，治疗中间及取针时各捻转20 s；肺肠同治组采用相同的方法，针刺双侧肺俞穴15 min后，针刺双侧天枢穴15 min，两穴共计施术30 min。3组大鼠上述干预结束1 h后，分别予以1%OVA溶液雾化20 min。以上所有干预均每天1次，连续14 d。实验流程详见图1。
肺俞(BL13)、天枢(ST25)定位参照《实验针灸学》及拟人比照法选取。
1.5 观察项目及检测方法
1.5.1 行为学观察
每天观察并记录大鼠的精神状况、反应能力、活动度、摄食量、摄水量、大小便等一般行为学变化，以及是否有挠鼻抓面、烦躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、口唇发绀等哮喘急性发作样反应。
1.5.2 肺功能检测
14 d干预结束后，将实验大鼠麻醉后，用小动物肺功能测定仪测定各组大鼠最大呼气流量(peak expiratory flow，PEF)、肺阻力(lung resistance，RL)、动态肺顺应性(dynamic lung compliance，Cdyn)、呼出75%肺活量时最大呼气流量(forced expiratory flow 75%，FEF75%)、呼出50%肺活量时最大呼气流量(forced expiratory flow 50%，FEF50%)、呼出25%肺活量时最大呼气流量(forced expiratory flow 25%，FEF25%)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in the first second，FEV1)、一秒用力呼气容积占用力肺活量比(forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC)及最大呼气中期流量(maximal mid-expiratory flow，MMEF)共10个项目，用计算机肺功能分析软件检测气道肺功能。
1.5.3 肺组织病理学观察
肺功能检测结束后，打开胸腔，剪取部分右肺中段组织，迅速将其浸入4%多聚甲醛固定24 h。经乙醇脱水后，置于60 ℃蜡盒内浸蜡、包埋、切片(厚4 μm)，分别于苏木素和伊红染液中染色、脱水、中性树胶固定、封片，光镜下观察肺组织病理学改变。
1.5.4 肺组织胶原沉积观察
选取经固定、脱水、浸蜡、包埋后的右肺中段组织，切片(厚4 μm)，采用Masson法对胶原进行染色。将肺组织进行抗原修复后，用苏木素-氯化铁混合液避光染色5 min后滴加酸性乙醇分化液，分化5 s后，用PBS缓冲液漂洗1 min，滴加碱性氨水溶液进行返蓝1 min，PBS缓冲液漂洗1 min，滴加立春红染液染色 5 min，滤纸吸去液体，滴加磷钼酸溶液反应 1 min后，滤纸吸去液体，滴加甲苯胺蓝染色液1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、中性树脂封片。
使用Case Viewer截取每张切片相同200倍视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image J软件将蓝色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出胶原面积。每只大鼠截取4张不同角度切片，以达到判断胶原面积的目的。经Masson染色后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维和红细胞呈红色。在光镜下观察胶原纤维(蓝色)的分布情况，并运用Image J图像处理软件分析各组胶原面积，胶原沉积程度 = 胶原面积 ÷ 组织总面积 × 100%。
1.5.5 支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)收集和细胞分类计数
大鼠麻醉后，仰卧位固定，颈部正中切开，钝性分离气管，以1 mL注射器插入气管，取1 mL PBS灌洗右肺，反复3次。灌洗液回收率大于80%。将灌洗液以3 500 r/min离心10 min，取上清液分装冻存于-20 ℃冰箱，待用。细胞沉淀做涂片，自然风干后使用4%多聚甲醛固定，进行瑞-吉染色，于200倍显微镜下分别计数嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。
1.5.6 肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-25、IL-33、LT、TSLP及PGD2的表达
气道肺功能检测结束后，剪取部分右肺中段组织，剪碎组织后按重量1:9加入裂解液于匀浆器进行匀浆。裂解30 min后将裂解液移至1.5 mL离心管中，在4℃下12 000 rpm离心5 min。取上清分装在0.5 mL离心管中并置于-20℃保存。严格按照酶联免疫吸附试剂盒操作说明进行，检测肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-25、IL-33、LT、TSLP及PGD2的含量。
1.6 统计学方法
所有数据均使用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，首先进行正态性、方差齐性检验。满足正态性者，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett T3法；不满足正态性时选择秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般情况比较
整个实验过程中，正常组大鼠反应灵敏，毛发整齐，形体健壮，呼吸节律整齐、均匀，大小便正常，口、鼻等部位无异常分泌物出现；模型组大鼠在OVA雾化激发后，逐渐出现四肢抓挠口鼻、频繁点头、呼吸喘促、打喷嚏等哮喘发作样反应，口、鼻部位可见白色黏性分泌物，腹式呼吸明显，肛周可见浅色质稀粪便。
2.2 各组大鼠肺功能的比较
与正常组相比，模型组大鼠肺功能中PEF、Cdyn、FEF25%、FEV1/FVC及MMEF显著下降(P<0.01或P<0.05)，RL显著上升(P<0.01)。与模型组相比，从肺论治组大鼠肺功能中仅FEF25%及FEV1/FVC显著上升(P<0.01，P<0.05)；肺肠同治组大鼠肺功能中PEF、FEF25%及FEV1/FVC均显著升高(P<0.01或P<0.05)，RL显著降低(P<0.05)。从肺论治组与肺肠同治组的肺功能各项检测指标均无显著性差异（P>0.05）。详见表1。
2.3 各组大鼠肺组织病理形态学的比较
经HE染色后，镜下可见正常组大鼠肺组织结构正常，肺泡壁结构完整，细胞排列有序。与正常组相比，模型组大鼠肺组织结构重度异常，肺泡壁增厚，肺重度实质化，支气管周围可见大量炎症细胞浸润和间质纤维组织增生。与模型组相比，从肺论治组和肺肠同治组大鼠肺泡壁增厚情况得到改善，结构较完整，支气管周围和肺泡组织内部分炎症细胞明显减少，细胞排列较为整齐。详见图2。
2.4 各组大鼠肺组织胶原沉积的比较
Masson染色后, 镜下可见正常组大鼠气道上皮下及气道周围可见少量胶原纤维沉积。与正常组相比，模型组大鼠气道黏膜可见平滑肌增厚和大量胶原纤维沉积，胶原阳性的蓝色面积明显增加。从肺论治组和肺肠同治组大鼠肺组织中仍可见不同程度的胶原纤维沉积，但与模型组相比，胶原纤维沉积明显减少。详见图3。
运用Image J图像处理软件分析后，与正常组相比，模型组大鼠肺组织胶原纤维沉积程度显著升高(P<0.01)。与模型组相比，从肺论治组和肺肠同治组大鼠肺组织胶原纤维沉积程度均显著降低(P<0.01)。从肺论治组与肺肠同治组大鼠相比，胶原纤维沉积程度无显著性差异(P>0.05)。详见表2。
2.5 各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞含量的比较
与正常组相比，模型组大鼠BALF中的中性粒细胞占比显著升高(P<0.05)；从肺论治组大鼠嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比与模型组差异无统计学意义(P＞0.05)，肺肠同治组大鼠中性粒细胞占比显著低于模型组(P<0.05)；从肺论治组与肺肠同治组的嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。
2.6 各组大鼠肺组织中炎症因子含量的比较
与正常组相比，模型组大鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33、LT、TSLP及PGD2的含量均显著增加(P<0.01)。与模型组相比，从肺论治组和肺肠同治组大鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、LT、TSLP及PGD2的含量均显著降低(P<0.01或P<0.05)；此外，肺肠同治组大鼠肺组织中IL-33的含量也显著降低(P<0.05)。与从肺论治组相比，肺肠同治组大鼠肺组织中IL-5的含量降低(P<0.05)。详见表4。
3 讨论
3.1 针刺肺俞和天枢对哮喘模型大鼠肺功能的影响
哮喘是临床上常见的呼吸系统疾病，除临床症状外，呼吸道高反应、可逆性气流阻塞等客观标准同样支持哮喘的诊断。因此，通过肺功能检测评估气道的阻力状况、可逆性和气道的高反应性，对哮喘的诊疗评估和机制分析具有非常重要的意义。
在诸多的肺功能评价指标中，已有研究证实，FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF75%等均是评估哮喘有效肺活量的参数。Cdyn和RL主要受肺组织弹性、胸腔容积、气道阻力大小等多重因素影响，FEV1、PEF及FEV1/FVC主要反映大气道的通气功能，PEF的变异率可以判断气流受限有无可逆性。FEF25%、FEF50%、FEF75%及MMEF可以反映小气道的通气功能，表示常规通气肺功能的非依赖用力呼气部分。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺功能中PEF、Cdyn、FEF25%、FEV1/FVC及MMEF均显著下降(P<0.01或P<0.05)，RL显著上升(P<0.05)，提示所制备模型大鼠的大、小气道通气功能均有不同程度的受限，气道功能有明显受损改变，反映了哮喘的程度。与模型组相比，从肺论治组与肺肠同治组大鼠FEF25%及FEV1/FVC显著上升，表明单独针刺肺俞或肺俞和天枢合用对哮喘模型大鼠有效肺活量，大、小气道通气功能受限均有一定的调节作用。与模型组相比，肺肠同治组大鼠的PEF显著升高，RL显著降低，提示针刺调节哮喘模型大鼠肺功能时，肺俞和天枢联用可改善呼气气流受限程度，减轻肺阻力；而从肺论治组大鼠PEF及RL与模型组差异无统计学意义。间接提示针刺调节哮喘模型大鼠肺功能时，肺俞和天枢联用的效应优于单用肺俞。
3.2 针刺肺俞和天枢对哮喘模型大鼠肺组织炎症的影响
哮喘是由于免疫细胞过度活化，释放过量炎症因子后损伤气道上皮，从而导致炎症反应持续性进展，并最终引发气道高反应性和气道重塑的慢性气道炎症性疾病。在整个哮喘发病过程中，气道免疫炎症贯穿始终，嗜酸性粒细胞炎症的程度与病情的严重程度成正相关，同时中性粒细胞也可能促进哮喘的发生。因此，调节体内炎性因子平衡，控制免疫炎症反应是治疗哮喘的关键。
通常认为辅助性T细胞1/辅助性T细胞2 (Th1/Th2)失衡是哮喘重要的发病原因。在哮喘的发病过程中，Th2能够分泌IL-4、IL-5和IL-13，气道上皮细胞可以产生IL-25、IL-33和TSLP。肥大细胞能够释放LT及PGD2等支气管收缩介质，参与呼吸道炎性反应过程，促进体内炎性细胞聚集。TSLP在哮喘患者气道上皮细胞和肥大细胞中的含量显著增加，能够直接刺激CD4+ T细胞释放Th2细胞因子，诱导过敏性炎症。IL-13可以通过刺激多种趋化因子的表达来诱发炎症，包括促进杯状细胞增生、气道平滑肌增殖等。IL-17A、IL-17F可以通过诱导气道上皮细胞和平滑肌细胞释放中性粒细胞，加重哮喘小鼠模型的气道炎症和气道高反应性，还与中性粒细胞介导的炎症有关。IL-25(也称作IL-17E)能够增加Th2细胞的数量，诱导IL-4、IL-5、IL-13的表达，出现由嗜酸性粒细胞介导的炎症反应。IL-33可以通过对染色质结构的影响来促进Th2细胞的分化，进而通过IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等细胞因子促进大量炎症介质的释放，使气道敏感性异常增加，诱发气道炎症。
有研究表明，电针天枢穴可以减低术后肠麻痹小鼠体内血清炎性因子的表达，能够抑制促炎因子的释放，调节免疫平衡，对于机体具有整体的调节作用。基于肠道菌群的“肠-肺轴”理论，更加明确了哮喘气道炎症因子与肠腑间的密切联系。肠道菌群作为生物量最高的微生物群落之一，在机体代谢和免疫方面的重要意义已为人们所熟识。根据“肠-肺轴”的概念，肠道微生物及其代谢物不仅能够调节胃肠道免疫，而且还可以通过淋巴或血液循环影响肺部免疫反应。本研究的结果显示，与模型组相比，从肺论治组和肺肠同治组大鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、LT、TSLP及PGD2的含量均显著降低(P<0.05)，表明单独针刺肺俞或肺俞和天枢合用均能有效调节哮喘模型大鼠的肺组织炎症反应。除此之外，肺肠同治组大鼠仍有肺组织中IL-33的含量显著降低，两针刺组相比，肺肠同治组大鼠肺组织中IL-5的含量明显低于从肺论治组。提示针刺调节哮喘模型大鼠肺组织炎症反应时，在IL-33、IL-5炎症因子的调节方面，肺肠同治可能通过多靶点调节Th2细胞的分化，控制体内嗜酸性粒细胞，减少相关炎性因子的分泌，从而发挥更好的效应。
3.3 “肺肠同治”与“从肺论治”效应差异的理论分析
基于“肺与大肠相表里”理论，肺与大肠经脉相通，生理上相互为用，病理上相互影响。呼吸道经鼻与外界相通，末端为肺；消化道经口与外界相通，末端为大肠，两者在咽部交汇。由此一来，临床上常见的肠、肺相关性疾病，特别是哮喘等肺系疾病中的肠道反应就可以得到合理的解释。另外，同属于粘膜免疫系统的肺与大肠，粘膜免疫可能是它们之间相互联系的桥梁，通过粘膜免疫可能形成肠-肺网络关系。因此，哮喘虽病位在肺，但与大肠有着密不可分的联系。《灵枢》有言，脏腑之气能够通过气街与背俞穴和募穴产生密切联系。故而本实验选用肺的背俞穴肺俞，与大肠的募穴天枢，作为肺肠论治的典型配穴使用，一前一后，两穴相配，共同调理脏腑气机。同时有研究发现，在天枢进行中药穴位贴敷，能够有效改善呼吸机相关性肺炎患者的肺顺应性及气道阻力。
在针灸临床上可以观察到，无论是“从肺论治”“从肠论治”还是“肺肠同治”，均可改善哮喘患者的肺功能，且“肺肠同治”的效应更明显。针灸治疗便秘患者肠腑病症的同时，对肺系症状也有一定的改善作用。本实验结果显示，与模型组相比，肺肠同治能显著降低哮喘模型大鼠BALF中的中性粒细胞占比，显著改善哮喘模型大鼠肺功能中PEF及RL，显著减轻肺组织的炎性因子中IL-33的含量；而肺论治组以上指标与模型组均无统计学差异；且肺肠同治组大鼠的IL-5含量明显少于从肺论治组。
综上所述，本研究结果提示，单独针刺肺俞或肺俞和天枢合用对哮喘模型大鼠的肺功能及组织炎症均具有一定的调节作用，而肺俞和天枢合用有优于单用肺俞的趋势。在今后的实验中，可能需要增加样本量以获得更为稳定的趋势，与此同时，“肺肠同治”这一诊疗思路在临床中的应用和推广同样亟需多中心、大样本的循证医学证据支持，对于其作用机制仍有待于进一步的研究和探讨。
参考文献
略
扫码关注我们
微信号｜zjtnyx
