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文献来源(引用本文)
LU C, XU J, LU Y, et al. Effect mechanism investigation of herb-partitioned moxibustion on relieving colon inflammation in Crohn disease rats based on neutrophil extracellular traps. J Acupunct Tuina Sci, 2024, 22(3): 173-183.
作者信息
路驰1, 徐静1,2, 陆嫄1,2, 吴璐一1, 包春辉1,2, 马喆1,2, 钟蕊1, 王照钦1,2, 孙可鑫1, 郑寒丹1,2, 翁志军1,2, 黄艳1,2, 吴焕淦1,2
1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院, 上海200437, 中国
2 上海市针灸经络研究所, 上海 200030, 中国
文献摘要
目的: 从中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)参与克罗恩病(CD)进展的角度, 阐释隔药灸减轻CD大鼠肠道炎症的效应机制。
方法: 采用2,4,6-三硝基苯磺酸制备CD大鼠模型, 将大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组和美沙拉嗪组。隔药灸气海和双侧天枢穴, 每日每穴2壮, 持续7 d。比较各组大鼠一般情况, 苏木精-伊红染色观察结肠组织病理学变化并评分。采用ABC 酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠血清中性粒细胞胞外诱捕网DNA(NETs-DNA)、中性粒细胞弹性蛋白酶DNA(NE-DNA)、过氧化物酶DNA(MPO-DNA)浓度, 采用免疫荧光和实时定量聚合酶链反应技术观察各组大鼠结肠组织瓜氨酸化组蛋白3(citH3)、MPO和NE蛋白和mRNA的表达。
结果: 与正常组比较, 模型组结肠黏膜溃疡深达肌层, 上皮不完整, 杯状细胞明显减少, 可见大量炎性细胞浸润, 结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分显著增加(P<0.01), 模型组血清NETs-DNA、NE-DNA、MPO-DNA浓度均增加(P<0.05), 模型组结肠组织NE、citH3和MPO蛋白和mRNA表达均上调(P<0.01或P<0.05); 与模型组相比, 隔药灸组和美沙拉嗪组结肠黏膜上皮修复, 杯状细胞明显增多, 可见少量炎性细胞浸润, CMDI评分明显降低(P<0.01), 隔药灸组和美沙拉嗪组血清NETs-DNA、NE-DNA、MPO-DNA浓度均下降(P<0.05), 隔药灸组和美沙拉嗪组NE、citH3和MPO蛋白和mRNA表达下调(P<0.01或P<0.05)。
结论: 隔药灸能降低血清中性粒细胞NETs复合物的浓度, 抑制结肠组织中的NETs复合物的蛋白和mRNA表达, 可能是隔药灸缓解CD结肠黏膜炎症的机制之一。
克罗恩病(Crohn disease, CD)是一种发病机制未明，反复发作的慢性非特异性炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)。目前认为，CD是由多种致病因素(如遗传易感性、环境因素、肠道菌群紊乱等)交互作用，引发机体先天免疫和获得性免疫失调所致。除腹痛、腹泻、便血等临床表现外，CD常可累及全身，出现长期消瘦、贫血等症状。病情长期反复发作，会严重降低患者的生活质量，影响正常工作和学习。流行病学研究显示，过去几十年间CD发病率呈全球性上升趋势，加重了社会经济负担。随着城市化进程的加快，我国CD发病率持续增长。CD目前尚不能治愈。西医运用氨基水杨酸制剂、抗生素、免疫抑制剂、生物制剂等方式控制CD症状，但不良反应、价格昂贵等限制了其临床应用。近年来，中医针灸在CD治疗中的疗效逐渐被重视。笔者所在课题组前期的随机对照临床试验证实针灸治疗轻、中度CD疗效确切；相关的动物实验也从抑制炎症因子表达、修复结肠黏膜屏障、调节肠道菌群稳态、调节自噬免疫相关基因等多角度多层面探讨了针灸治疗CD的可能效应机制。
中性粒细胞可迅速被招募到感染或组织损伤部位以遏制炎症。在CD的长期病程中，由于炎症的长期存在，会使得中性粒细胞持续激活和过度招募。中性粒细胞在CD肠道炎症中有重要作用，可通过释放蛋白酶，促进炎症细胞因子和介质，如白介素(interleukin, IL)-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α等，破坏结肠黏膜上皮屏障，招募单核细胞和更多的中性粒细胞到肠道。结肠中性粒细胞浸润与CD的疾病活动相关。研究发现，IBD患者的肠道黏膜、粪便和血液中，中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)形成增加，其数量与疾病活动度呈正相关。CD患者结肠组织中NETs相关蛋白表达显著高于正常人；给予抗TNF-α治疗后降低了NETs的表达。靶向NETs可能形成一种新的疗法，促进肠黏膜完全愈合。针灸治疗CD有效，其机制可能与调节NETs生物学功能有关。因此，本研究聚焦NETs探讨针灸对CD结肠黏膜的保护效应机制，为针灸治疗CD提供更科学的实验基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性无特定病原体(specific-pathogen-free)级Sprague-Dawley大鼠40只，约4周龄，体质量(100±20) g，由上海中医药大学实验动物中心提供[SYXK(沪)2020-0009]。饲养环境：12 h/12 h昼夜节律交替，室温(20±2) ℃，室内湿度50%-70%。适应性饲养1周。动物实验通过上海中医药大学伦理委员会审查，伦理审批号：PZSHUTCM210305005。所有动物实验操作在上海中医药大学伦理委员会指导下进行。
1.2 主要试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
苏木素、伊红、中性树胶、二甲苯、乙醇(国药集团化学试剂有限公司，中国)；戊巴比妥钠(货号P-010，Merck，德国)；NET-DNA复合物ELISA试剂盒(货号FD02028，上海西唐生物科技有限公司，中国)；兔抗citH3抗体(1:1 000, 货号ab5103，Abcam，英国)；兔抗MPO抗体(1:1 000, 货号ab208670，Abcam，英国)；兔抗NE抗体(1:3000, 货号ab177487，Abcam，英国)；二抗：山羊抗兔(1:100, 货号111-543-003，Jackson，美国);Trizol (货号15596018, Invitrogen, 美国); RT reagent 试剂盒 (货号RR047A, TAKARA, 日本); TB Green qPCR 试剂盒 (货号 RR420A, TAKARA, 日本)。
1.2.2 主要仪器
ATP700(ST)组织脱水机(Hestion，中国)；EG 1160组织包埋机(Leica，德国)；RM 2235石蜡切片机(Leica，德国)；HI 1220组织烘片机(Leica，德国)；BX53光学显微镜(OLYMPUS，日本); FrescoTM 17 4℃离心机(Thermo Fisher Scientific Inc.，美国); -80℃低温冰箱(Thermo Fisher Scientific Inc.，美国); 酶标仪(Thermo Fisher Scientific Inc.，美国);分析软件：Ascent software for Multiskan；Light Cvcler实时定量聚合酶链反应 (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)仪( Roche，瑞士)。
1.3 模型制备
采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)制备CD大鼠模型。实验前禁食不禁水24 h，1%戊巴比妥钠[40-50 mg/(kg·bw)]腹腔麻醉大鼠，将5%(W/V)的TNBS与50%乙醇按2:1体积比混合成灌肠液，按照3 mL/(kg·bw)剂量于距肛门6-8 cm处注入灌肠液，每周1次，连续4周。
1.4 分组与干预方法
将40只大鼠用SPSS26.0软件随机分为非造模组(n=10)和造模组(n=30)。模型制备期间死亡4只造模组大鼠。剩余10只非造模组大鼠和26只造模组大鼠。每组选取2只大鼠进行模型鉴定以确定模型制备效果。在模型制备成功后，将24只造模组大鼠随机分为模型组、隔药灸组和美沙拉嗪组，每组8只。剩余8只未造模大鼠为正常组。
正常组：正常组不做任何治疗，只做与其他组相同的固定。
模型组：模型组不做任何治疗，只做与其他组相同的固定。
隔药灸组：用透气避光的手套套住大鼠，待大鼠应激状态结束后，使其腹部向上用绑带固定在大鼠治疗架上。取气海和双侧天枢进行隔药饼灸治疗。将制附子、肉桂、黄连等药粉加黄酒拌成厚糊状，用模具制成直径0.8 cm，厚 0.4 cm的药饼。以精制艾绒制成艾炷，重量约90 mg，每次每穴隔药灸2壮，每日1次，持续干预7 d。
美沙拉嗪组：美沙拉嗪肠溶片(国药准字HJ20202002, Losan Pharma GmbH, 德国)， 每日投药量按成人(体质量70 kg，4 g/d)与大鼠(体质量200 g) 56:1比例配成灌胃液，每日1次，每次1 mL，持续灌胃7 d。
1.5 样本采集与处理
2%戊巴比妥钠[40-50 mg/(kg·bw)]麻醉大鼠后剖开腹腔，用5 mL BD一次性真空非抗凝采血管于腹主动脉采集约3 mL动脉血，室温静置30 min后4 ℃ 3 000 r/min离心10 min。取上清液（即血清) 分装至EP管中，于-80℃冰箱保存备用。取距肛门2-10 cm的结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，生理盐水冲洗，最远端1 cm结肠用4%多聚甲醛固定，其余部分剪碎混匀，置于EP管液氮冷冻1 h后-80 ℃冰箱保存备用。
1.6 检测项目
1.6.1 结肠上皮组织形态学观察
将固定24 h的结肠组织脱水、石蜡包埋，并制成4 μm厚的切片。将结肠组织切片脱蜡至水，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min，双蒸水漂洗5 min，2次，苏木精染色液2 min，流水冲洗10 min，1%盐酸酒精分化5 s，流水冲洗5 min，伊红染色液2 min，70%、80%、90%、100%乙醇脱水各8 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min，中性树脂封片。 苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色后，光镜下观察结肠黏膜上皮、腺体，炎性细胞浸润等形态学情况。
1.6.2 外周血NETs-DNA检测
采用双抗体夹心ABC酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 法，通过绘制标准曲线计算各样本NETs-DNA的浓度。每孔加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后37 ℃ 静置40 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，用滤纸吸干残留洗涤液。每孔加入蒸馏水和一抗工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后37 ℃静置20 min。洗板后每孔加酶标抗体工作液100 μL。将反应板37℃静置10 min。洗板后每孔加入底物工作液100μL，置37 ℃暗处反应15 min。每孔加入100 μL终止液混匀。30 min内用酶标仪在450n m处测吸光值。
1.6.3 组结肠组织NETs复合物蛋白和mRNA的表达
采用免疫荧光检测结肠组织NETs复合物的蛋白表达。将切片脱蜡至水后，抗原修复，用1×PBS洗3次，加5% BSA封闭液室温封闭40 min，加兔来源的一抗置于湿盒内4 ℃孵育过夜，次日用1×PBS洗3次后加对应荧光标记的山羊来源的二抗，37 ℃避光孵育60 min，用 1×PBS洗3次后加DAPI溶液，室温避光孵育10 min，封片后荧光显微镜下观察。
采用RT-qPCR观察NETs mRNA表达。取冻存的结肠组织，采用Trizol法提取总RNA，检测浓度及其纯度，定量后采用试剂盒逆转录成cDNA，配置好反应溶液后在Roche RT-qPCR系统上扩增，反应条件为93 ℃ 2 min预变性，然后93 ℃ 1 min，根据引物设置退火温度58-60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环，最后72 ℃ 7 min延伸。反应完成后，分析数据，采用2-△△Ct 法对所得数据进行计算。各目的基因及内参基因的引物信息见表1。
1.7 统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。对计量资料进行正态分布检验，均服从正态分布，以均数±标准差表示。方差齐的计量资料组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance)。以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般情况比较
正常组大鼠活动、饮食如常，大便性状未见异常，皮毛光滑；模型组大鼠状态差，体型瘦小，少食懒动，皮毛暗淡污秽，稀便，部分大鼠出现血便，腹部鼓胀；隔药灸组和美沙拉嗪组大鼠总体状态较模型组显著改善，体型较模型组有所增大，皮毛比较粗糙，欠缺光泽，腹部较为平坦，粪便多成形，未见黏液血便，偶有稀便，活动较为正常。
2.2 各组大鼠结肠组织病理学变化的比较
大鼠结肠组织HE染色显示，正常组结肠组织结构完整，隐窝排列整齐，大量的杯状细胞，无炎性细胞浸润；模型组溃疡深达肌层，结肠上皮不完整，局部黏膜缺失，隐窝形态异常，杯状细胞明显减少，可见大量炎性细胞浸润；隔药灸组和美沙拉嗪组可见结肠黏膜溃疡愈合，隐窝排列趋于整齐，较多的杯状细胞，可见少量的炎性细胞浸润(图1)。
与正常组相比，模型组大鼠结肠黏膜损伤指数(colonic mucosa damage index, CMDI)评分显著升高(P<0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组较模型组显著下降(P<0.01)。详见图2。
2.3 各组NETs-DNA、MPO-DNA和NE-DNA蛋白浓度比较
NETs及其复合物血清中的蛋白浓度定量结果显示，模型组血清NETs-DNA的蛋白浓度较正常组显著升高(P<0.01)，隔药灸组和美沙拉嗪组NETs-DNA的蛋白浓度较模型组均显著下降(P<0.01)。NETs主要复合物MPO-DNA和NE-DNA的蛋白浓度在模型组血清中均显著升高(P<0.05)，血清MPO-DNA在隔药灸组和美沙拉嗪组中显著降低(P<0.05)，血清NE-DNA在隔药灸组和美沙拉嗪组中亦显著降低(P<0.01)。详见图3。
2.4 各组结肠组织NETs复合物蛋白表达比较
2.4.1 各组结肠组织NE蛋白表达比较
免疫荧光染色法检测NE蛋白表达。与正常组相比，NE(绿色)在模型组结肠组织炎症部位中性粒细胞中有较多的阳性表达；与模型组相比，隔药灸组和美沙拉嗪组结肠组织NE阳性表达较少(图4)。
2.4.2 各组结肠组织citH3蛋白表达比较
免疫荧光结果显示，在正常组结肠组织瓜氨酸化组蛋白(citrullinated histone 3, citH3)蛋白阳性表达(绿色)较少，模型组citH3蛋白阳性较多，隔药灸组和美沙拉嗪组citH3蛋白阳性表达较少(图5)。
2.4.3 各组结肠组织MPO蛋白表达比较
免疫荧光染色显示，正常组大鼠结肠组织过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO)阳性表达(绿色)很少，模型组结肠组织MPO阳性表达较多，隔药灸组和美沙拉嗪组结肠组织MPO阳性表达较少(图6)。
运用ImageJ对各组大鼠结肠组织NETs复合物进行蛋白荧光定量分析，比较各组目标蛋白的平均光密度值（Average optical density，AOD）。结果如表2所示。与正常组相比，模型组结肠组织NE、citH3和MPO蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，隔药灸组和美沙拉嗪组NE、citH3和MPO蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
2.5 各组结肠组织NETs复合物mRNA表达比较
RT-qPCR结果显示，模型组NE mRNA和citH3 mRNA表达均较正常组显著升高(P<0.05)，与模型组相比，隔药灸组和美沙拉嗪组NE mRNA表达降低(P<0.01，P<0.05)。citH3 mRNA表达在隔药灸组和美沙拉嗪组显著降低(P<0.01)。与正常组相比，MPO mRNA在模型组表达显著升高(P<0.01)，与模型组相比，隔药灸组和美沙拉嗪组MPO mRNA表达降低(P<0.01)。详见图7。
3 讨论
CD在中医学中归属“泄泻”“腹痛”等范畴。灸法自古就被应用于泄泻病症的治疗。天枢是治疗肠腑病证的要穴，是大肠募穴，对腹痛、腹泻等肠腑疾病具有关键作用，是治疗CD的首选穴位。任脉行于腹部正中，与胃、大肠、小肠等脏腑联系密切。气海为先天元气聚会之处，生气之海，是保健要穴，有补益之功，对腹痛、泄泻具有良好的功效。天枢、气海相配是课题组经过临床和动物实验证实的改善CD肠道症状的有效经验选穴。
BRINKMANN V, et al发现中性粒细胞被激活后，细胞外纤维会释放一些颗粒蛋白和染色质，与革兰氏阴性菌和阳性菌结合，起到降解毒性和杀菌的作用。这种以染色质为基本骨架，附着颗粒蛋白等多种组分的特殊结构，被命名为NETs。颗粒蛋白（如MPO、NE和citH3) 的共表达，被认为是NETs释放的标志。由于NETs在诸多疾病的病理过程中发挥着重要作用，如癌症、系统性红斑狼疮、银屑病、IBD等，近年来吸引了越来越多研究者的目光。随着研究的深入，NETs作用的双刃剑特点也被逐步揭示，如既具有杀灭病原微生物的作用，又可以促进肿瘤转移，参与血栓形成，促进动脉粥样硬化斑块形成等。随着NETs的生物学作用在许多疾病炎症过程中有了新认识，NETs可能成为CD治疗的新靶点，以促进肠黏膜完全愈合。
当结肠黏膜暴露于高水平的病原微生物（如细菌、病毒、真菌等) 环境下时，NETs起到了防御作用；然而，NETs过度释放也会导致肠道炎症加重或持续。已有多项研究证实，在CD患者的粪便、血液样本以及结肠组织中，均可以检测出表达异常升高的NETs。借助气相色谱-质谱技术的蛋白质组学研究，LEHMANN T, et al发现NETs关键蛋白MPO和NE在IBD患者粪便中的含量较健康受试者显著增加。MASUDA S等人的研究发现，CD患者外周血MPO-DNA复合物表达升高，受损的结肠黏膜中NE和citH3表达显著增加。NETs复合物中MPO的浓度与CD患者结肠组织病理学严重程度呈正相关，利用特定荧光染色技术观察到了NETs标记物在CD患者的肠道活检组织中形成的NETs三维图像。CD为慢性炎症，其肠道黏膜屏障免疫功能失调长期存在，反复发作的炎症引起结肠结构和功能的变化。在CD活动期和缓解期，肠道炎症状态明显不同，中性粒细胞的作用也不同。
本研究中，隔药灸干预TNBS诱导的CD模型大鼠天枢、气海，能显著改善稀便、便血等症状，降低CMDI评分，缓解结肠黏膜炎症，促进受损黏膜修复。以上结果与课题组既往研究结论一致。艾灸天枢、气海具有温养脾胃之功效，对CD具有较好的抗炎作用。在明确艾灸减轻CD大鼠结肠炎症的效应基础上，从NETs参与肠道炎症的角度进行研究, 发现CD大鼠血清中NETs-DNA、MPO-DNA和NE-DNA蛋白浓度均显著高于正常大鼠，结肠组织NETs复合物NE、MPO和citH3蛋白荧光显著增强。有学者在临床试验中发现，CD患者外周血MPO-DNA复合物表达升高，炎症部位结肠黏膜中NE和citH3表达也显著增加。本研究中CD大鼠的外周血MPO-DNA的结果和临床试验研究的结果一致；结肠组织中NE和citH3蛋白荧光明显增强，与临床研究结果也一致。本研究结果发现，隔药灸具有一定的抑制CD大鼠结肠炎症的作用，这可能与隔药灸降低了血清中NETs复合物的DNA和蛋白含量，以及抑制了结肠NETs复合物NE、MPO和citH3 mRNA和蛋白表达有关。
综上，本研究发现，隔药灸可改善CD大鼠结肠症状，缓解结肠黏膜炎症，促进受损结肠黏膜修复。以NETs异常释放为切入点，观察到隔药灸具有降低CD大鼠血清NETs复合物浓度，抑制结肠组织NETs复合物的蛋白和mRNA表达的作用，这可能是隔药灸干预CD的效应机制之一，我们对这一发生机制尚缺乏更全面深入的了解。隔药灸抑制NETs复合物的作用通路还有待进一步深入研究。目前，中性粒细胞在CD发病机制中的作用仍存争议，一定程度上抑制中性粒细胞对缓解CD肠道炎症有益，而抑制过度则会带来负面影响。MPO与NETs形成过程中的氧化应激密切相关，今后可以结合MPO基因敲除小鼠、MPO抑制剂等，从中性粒细胞氧化应激相关的信号通路切入，进一步探讨隔药灸减轻CD肠道炎症的效应机制。
参考文献
略
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