如何研发一款RSV mRNA疫苗？详解非临床评价和生物分析要点
文摘
科学
2024-07-19 19:00
上海
自2023年以来，全球呼吸道合胞病毒（RSV） mRNA疫苗赛道的研究和开发捷报频传。仅2024年，CDE就批准了3个RSV mRNA项目进入临床研究。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有其独特优势，但也在非临床评价和生物分析等研究过程中带来了难题和挑战，解决这些问题的策略和方法成为项目能否顺利推进和能否脱颖而出的关键。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是一种包膜、负义、单链，具有15.2 kb的RNA基因组的RNA病毒，属于单肺炎病毒科正肺炎病毒属。它是婴儿和老年人呼吸道感染的主要原因。2019年，全球5岁以下儿童中因感染RSV引起的住院病例超过360万，死亡病例超过10万，1-6个月龄婴儿中有36%的死亡与RSV的感染相关，给婴幼儿和老年人带来了沉重的疾病负担。
RSV可分为RSV型A（RSV-A）和RSV型B (RSV-B）两个亚型。RSV病毒基因组由核蛋白（N）封装的单链负义RNA组成，RSV的RNA转录和复制由RSV的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，简称RdRP）转录和复制。RdRP由多功能聚合酶蛋白（Large，简称L）和辅因子磷蛋白（Phosphoprotein，简称P）组成。RSV病毒的10个基因编码11个蛋白，其中融合（F）糖蛋白、附着（G）糖蛋白和小疏水（SH）蛋白是脂质双分子层外膜上的表面蛋白。SH蛋白并不参与病毒感染。F糖蛋白为RSV的表面蛋白，是帮助病毒进入宿主细胞感染的必需蛋白，在细胞与病毒膜的融合过程中起着关键作用。2013年，研究人员设计并表达出稳定的RSV融合前F蛋白（Pre-F），动物试验结果显示，Pre-F诱导的中和抗体滴度比融合后F蛋白高出约80倍，F蛋白的融合前构象是强效中和抗体的重要靶标，并且该蛋白在RSV-A和RSV-B亚型中高度保守。![]()
图源：Bianchini S, Silvestri E, Argentiero A, Fainardi V, Pisi G, Esposito S. Role of Respiratory Syncytial Virus in Pediatric Pneumonia. Microorganisms. 2020; 8(12):2048. https://doi.org/10.3390/microorganisms8122048RSV的预防策略主要包括避免RSV暴露的预防措施以及被动免疫和主动免疫。使用单克隆抗体的被动免疫是一种用于高危婴儿的方法。- 1998年，FDA批准了首款治疗儿科RSV感染的人源化单抗palivizumab （Synagis）上市，但该药仅在美国获批用于治疗早产儿。
- 2023年7月，FDA又批准了Nirsevimab（Beyfortus）用于预防新生儿和儿童的RSV下呼吸道疾病。
主动免疫主要针对特定的易感人群，具体而言，由于易感性高，免疫策略主要针对婴儿、儿童、孕产妇和老年人群体。相对于被动免疫而言，主动免疫进展缓慢。在mRNA技术平台成熟之前，RSV疫苗的研发经历了坎坷的两个阶段：第一阶段RSV的减毒及灭活疫苗不但没有对接种者产生保护性，反而出现了疾病增强作用（Enhanced Respiratory Syncytial Virus Disease，ERD，即接种者不但不能预防感染RSV病毒，反而会导致接种者感染RSV后病情加重），在安全性上受到了很大挑战；第二阶段以RSV病毒结构中的F蛋白为药物靶点，Novavax和GSK公司的疫苗也因为未达到临床试验重点而失败，究其原因应该跟RSV病毒结构的不稳定性有关。目前，已上市或已开发的RSV疫苗主要包括mRNA疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗或重组载体疫苗。Arexvy（葛兰素史克）是第一种可用于预防老年人下呼吸道感染的疫苗，于2023年5月获美国FDA上市批准用于60岁及以上年龄段人群。随后辉瑞的Abrysvo也获得上市批准，并进一步授权用于妊娠32-36周的孕妇，以预防出生至6个月大的婴儿因RSV发生的下呼吸道感染。2024年5月，FDA批准了Moderna的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗mRESVIA（mRNA-1345）上市，用来预防60岁及以上人群出现由RSV引起的下呼吸道疾病（LRTD）。已上市RSV疫苗的信息如下：![]()
RSV mRNA疫苗的
研发与挑战
mRNA作为疫苗平台，只携带特定蛋白的遗传信息，由于宿主遗传物质受到干扰和修饰的可能性较低，因此具有较高的安全性。此外，与已被广泛使用的蛋白质疫苗相比，mRNA疫苗的无细胞生产方式不仅加快了疫苗的研发周期，还提高了生产效率和规模化生产的可能性。mRNA疫苗能编码多种抗原，适应多样化的微生物或病毒变体，同时结合编码抗原和佐剂的双重功能，有效激发免疫反应。mRNA疫苗诸多不同于传统疫苗的特点也为研究人员带来了更多需要关注和考量的因素，尤其mRNA在体内需要特定递送载体，而载体具有一定的佐剂效应，需额外注意。益诺思在mRNA疫苗品类已经建立了成熟的评价体系，积累了数个成功申报的项目经验，总结了以下需要重点考虑的问题：LNP包裹mRNA疫苗的药效学研究主要是考察疫苗在相关动物种属体内引起的与人体相关的免疫应答，即免疫原性研究。使用LNP包裹mRNA疫苗的棉鼠对RSV-A和RSV-B攻击具有完成的保护作用，并且未见与疫苗相关的呼吸道疾病增强作用。此外，mRNA翻译的抗原片段递呈给CD4+T、CD8+T细胞，最终激活细胞免疫，诱导强烈的CD4+T、CD8+T细胞免疫应答，即提示mRNA类的RSV疫苗在激活细胞免疫应答方面具有潜在优势。随着时间的推移，疫苗激发的免疫应答水平会逐渐下降，了解免疫应答的持续时间，对于评估免疫程序也是至关重要。世界卫生组织（WHO）发布的《Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations》中指出除关注免疫应答的持久性还需关注具有持久性的免疫细胞表型，特别是被认为与候选疫苗诱导保护作用相关的免疫应答持久性。根据WHO对mRNA预防性疫苗的考虑，mRNA类的RSV疫苗需进行组织分布研究，通过对目的mRNA和LNPs（或脂质成分）在接种组织中的存留时间、从接种组织分布到哪些主要组织以及持续时间的研究，为mRNA疫苗潜在的安全性提供数据支持。和RSV重组疫苗一样，mRNA类的RSV疫苗也需要选用相关种属或品系的动物进行非临床安全性评价；至少选择一种相关动物种属进行长期毒性试验；接种剂量原则上应使疫苗在动物体内达到最佳的免疫应答；接种次数建议至少比临床拟定的接种次数多一次；接种间隔一般应根据动物的免疫应答而确定。mRNA类RSV疫苗可通过多种途径引发炎症反应， mRNA和LNPs都具有可以影响和触发固有免疫系统的特性，更需要监测全身的毒性和局部的炎症反应。递送载体中的聚乙二醇（PEG），虽然相对无害，但也会影响理化特性，进而影响安全性。同时，前期的福尔马林灭活RSV疫苗曾激活了Th2-CD4+T细胞，导致了细胞因子介导的肺炎发生。因此，对mRNA类RSV疫苗更需要关注给药部位炎症反应、免疫毒性反应、肝脏毒性以及呼吸系统毒性。mRNA类RSV疫苗需要选用敏感动物进行生殖毒性研究。由于mRNA类RSV疫苗可诱导更强的体液免疫和细胞免疫应答，可能影响胚胎或新生儿的发育。因此，生殖毒性试验研究可先考察疫苗对动物胚胎和幼仔发育的影响，如有担忧，可考虑进行I/II/III段的组合试验。由于试验动物的妊娠周期通常较短，为使动物在整个妊娠期间充分暴露，一般需在交配前接种，接种间隔根据动物的免疫应答而确定，必要时应在妊娠期间进行加强免疫，以维持妊娠期间疫苗诱导的最佳免疫应答。WHO发布的《Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations》中指出，mRNA基本不存在整合到宿主基因组的可能性。- 首先，关于RNA整合到宿主基因组的机制需要包含逆转录酶和整合酶的复合物；
- 其次，mRNA候选疫苗的设计应考虑到不应包含逆转录酶启动转录所需引物的特定RNA结合位点；
- 再次，RNA经逆转录并组成新产物后才可能被转移到细胞核中；
- 最后，疫苗中mRNA一旦被人体细胞摄取，就会在相对较短的时间内降解，细胞自身的mRNA亦是如此。
但近期针对Pfizer和BioNTech联合研发的BNT162b2的研究表明，其可在人肝细胞系中实现逆转录，研究发现BNT162b2激活并增加了人体细胞内的自主逆转录转座子LINE-1基因的表达，而LINE-1作为细胞内源性逆转录酶，能够介导RNA在肝细胞系Huh 7中被逆转录为DNA。这一发现可能导致需要重新审视mRNA疫苗的整合或遗传风险。因此，对于mRNA类RSV疫苗来说，如有担忧需考虑遗传毒性试验。由于用于配制LNPs的脂质会影响颗粒的总电荷，当使用由新型脂质制成的LNPs或LNPs本身进行修饰时（例如，改变比例或修改工艺），并且这些LNPs先前未在LNPs封装的mRNA产品中进行非临床和临床试验，那么需要对含有新型脂质（或任何新型辅料）的LNP进行毒性研究，包括：药代动力学研究（吸收、分布、代谢和排泄）、安全药理试验、单次/重复给药毒性试验、遗传毒性试验、生殖毒性试验以及制剂安全性试验（非口服途径）。RSV免疫原性检测中和抗体（NAb）检测是评估RSV疫苗效力的关键方法，在非临床和临床评价中都需重点关注。该检测通过检测疫苗诱导的抗体在体外抑制RSV感染细胞的能力来评估疫苗的免疫原性。目前有几种常用的NAb检测方法，可以根据供试品的特点和研究需求来进行选择：- 斑块减少中和试验（PRNT）是一种广泛应用的经典方法。在PRNT中，将受试者的血清样本与预定剂量的RSV孵育，然后将混合物添加到易感细胞单层上。通过定量病毒斑块的减少来评估RSV感染的抑制程度。PRNT的优势在于其高灵敏度和对中和抗体功能的直接评估。然而，其缺点包括操作繁琐、耗时较长，以及需要处理活病毒，这可能带来生物安全风险。
- 微量中和试验（Microneutralization assay）采用类似的原理，但在96孔板上进行，实现了更高的通量和更小的样本需求。相比PRNT，它的操作相对简单，适合大规模筛选。然而，其灵敏度可能略低于PRNT，且结果可能受试剂和操作条件的影响较大。
- 免疫染色技术可与上述方法结合使用，通过检测病毒抗原。这种方法的优势在于能够提供病毒感染和抑制的定性信息。然而，它需要额外的步骤和试剂，增加了检测的复杂性和成本。
- 报告病毒检测利用表达报告基因（如GFP或荧光素酶）的重组RSV，通过测量报告信号的减少来提供快速且灵敏的检测方法。其优点是操作迅速、灵敏度高，且不需要处理活病毒。然而，这种方法可能需要专门的设备和试剂，且报告基因的表达可能受多种因素影响，导致结果变异。
- 基于伪病毒的中和试验使用携带RSV表面糖蛋白但不含RSV基因组的假病毒颗粒。伪病毒系统的优势在于可以在BSL-2实验室进行操作，避免了活病毒带来的安全风险，同时保持了较高的特异性和灵敏度。近年来，该方法在RSV疫苗研究中得到了广泛应用。
为了确保不同研究和实验室之间结果的一致性和可比性，WHO也提供了标准RSV抗体血清。该标准血清作为参考物质，可用于校准检测的敏感性和标准化结果。使用WHO标准血清有助于统一NAb检测方法，确保来自不同来源的数据具有可比性和可靠性。最后，值得注意的是，虽然NAb水平通常被认为是疫苗保护效力的重要指标，但RSV疫苗的保护机制可能还涉及其他免疫反应，如T细胞介导的细胞免疫和黏膜免疫。因此，全面评估RSV疫苗的有效性还需要结合其他免疫学指标和临床终点。这些NAb检测方法，结合WHO标准血清的使用以及对多种免疫指标的综合评估，在优化评估RSV疫苗候选物的免疫原性和保护潜力方面发挥着关键作用。益诺思秉承“科学引领”的企业使命，已经为包括RSV mRNA疫苗在内的多种创新品类药物的临床前研发和临床试验样本分析，基于对生命科学和药学的学术研究，对现行法规和指导原则的深入解读以及丰富的行业项目合作经验，建立了一套科学系统的研究和评价体系，助力RSV mRNA疫苗项目顺利从早期成药性阶段一路推进临床。截止目前，益诺思已经参与了20+个mRNA疫苗项目的研发和评价工作，其中5个项目已经获得NMPA的IND批件。
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