蛇咬伤是一种被忽视的热带疾病，每年在全球造成约 10 万例死亡和 30 万例永久性残疾，尤其对撒哈拉以南非洲、南亚、拉丁美洲等资源匮乏地区的公共健康构成重大威胁。2017 年，世界卫生组织将蛇咬伤列为优先处理的被忽视热带疾病之一。然而，现有治疗手段主要依赖于从免疫动物血浆中提取的多克隆抗体（抗蛇毒血清）。但是，该疗法存在生产成本高、疗效有限、副作用显著、冷链需求高等局限性，亟需开发一种既能广泛中和目标毒素又具备高热稳定性、低生产成本的抗蛇毒治疗方案。
2025 年 1 月 15 日，来自美国华盛顿大学的 David Baker 教授（2024 年诺贝尔化学奖得主）在 Nature 发表研究论文「De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins」（图 1）。该研究通过 de novo 蛋白质设计方法，开发了一种新型抗蛇毒蛋白，用于有效中和蛇毒中的三指毒素。这种方法不依赖动物免疫，并且具有亲和力高、制造成本低、适应性广泛、稳定性强的优势。弥补了传统抗蛇毒血清的不足，并在被忽视的热带疾病治疗中实现了突破。
图 1 相关研究（图源：[23]）
三指毒素（Three-finger toxins，3FTx）是眼镜蛇类蛇毒中高度毒性的成分（图 2），能够引发多种病理损害，包括严重的组织损伤以及对烟碱型乙酰胆碱受体的抑制，从而导致危及生命的神经毒性。
图 2 三指毒素（3FTx）的作用靶点（图源：[23]）
短链和长链 α-神经毒素（α-neurotoxins）是 3FTx 的关键成分，许多眼镜蛇类蛇毒的致命性源自这些毒素，因此，为实现治疗效果并防止蛇毒致死，必须中和这两种类型的 α-神经毒素。研究者为了实现功能性中和，聚焦于通过空间位阻阻止神经毒素结合 nAChR 的结合模式。通过对每个神经毒素暴露的边缘 β 链逐一进行条件化的 RFdiffusion 轨迹计算，这些轨迹受次级结构和块邻接张量的引导，使生成的设计能与目标蛋白形成延展的 β 片层。随后，利用 ProteinMPNN 对生成的骨架进行序列设计，并通过 AlphaFold2（AF2）初步预测以及 Rosetta 评估标准对设计结果进行筛选，最具潜力的候选蛋白进行体外实验验证。
针对短链毒素（Consensus toxin derived from elapid snakes，ScNtx），设计的 SHRT 蛋白展现出极高的结合亲和力（Kd = 0.9 nM）和热稳定性（Tm = 78°C）；针对长链毒素（α-cobratoxin），设计的 LNG 蛋白表现出类似的高结合能力（Kd = 1.9 nM）和优异的热稳定性（Tm > 95°C）。晶体结构分析进一步验证了设计蛋白与毒素的结合符合模型预测，主要通过 β 链对接和关键残基形成氢键。这些设计蛋白在体外实验中成功阻断了毒素对烟碱型乙酰胆碱受体的作用，并在小鼠模型中实现了有效的毒素中和（图 3、图 4）。
同时，研究者希望靶向细胞毒素 ——3FTx 中的另一个重要功能类群，广泛存在于眼镜蛇毒中。研究者发现，细胞毒素通过三指环与磷脂膜相互作用，导致局部组织破坏，因此需要设计直接结合三指环的蛋白以阻止其插入细胞膜。研究者首先基于 86 种细胞毒素的共识序列作为靶点，结合 RFdiffusion，设计出与三指环区域互补的结合蛋白骨架，并通过 ProteinMPNN 优化序列。最终筛选出的 CYTX 蛋白展现了良好的溶解性、单体性和高亲和力（Kd = 271 nM），并在体外实验中有效中和了多种眼镜蛇毒液（如 Naja pallida 和 Naja nigricollis）中的细胞毒素，保护细胞免受毒素引发的损伤。然而，在体内实验中，CYTX 对皮肤坏死的保护效果有限，推测原因是其结合亲和力仍需进一步优化。晶体结构解析表明，CYTX 与细胞毒素的三指环通过一系列氢键和静电相互作用紧密结合，验证了设计的结构与功能的一致性，并展示了 RFdiffusion 技术对复杂靶点设计的能力（图 3、图 4）。
图 3 三指毒素（3FTx）结合蛋白的实验表征（图源：[23]）
图 4 三指毒素（3FTx）结合蛋白的晶体结构（图源：[23]）
最后，研究者评估了 SHRT、LNG 和 CYTX 三种结合蛋白在体外和体内中和蛇毒的效果。在体外实验中，针对 α-神经毒素的 SHRT 和 LNG 结合蛋白在 1:1 摩尔比下完全中和了目标毒素对烟碱型乙酰胆碱受体的阻断作用，其效果优于现有的抗体和纳米抗体；针对细胞毒素的 CYTX 结合蛋白在 1:5 摩尔比下有效保护了 70%-90% 的细胞免受蛇毒中细胞毒素的损伤。在体内实验中，SHRT 和 LNG 结合蛋白在短链和长链毒素小鼠模型中展现了显著的保护能力，预防模式下 100% 保护小鼠免于毒素致死；在救治模式中，SHRT 提供了 100% 的保护，而 LNG 的保护率随给药延迟略有下降（30 分钟时为 60%）。这表明设计的结合蛋白具有高效的体外中和能力和良好的体内保护效果，为开发新型抗蛇毒疗法奠定了基础。
Nature
传统上，蛋白质纳米笼通常由一个或多个相同类型的亚基组成，并以四面体、八面体和二十面体点群对称性排列。然而，自然界中，病毒可以通过引入不同的亚基或改变相同亚基的构象（即对称性破缺），构建出更高 T 数的二十面体病毒壳体，从而实现更复杂的功能，例如包装和递送大型核酸货物。然而，这种对称性破缺的策略尚未在人工设计的蛋白纳米结构中得到充分利用。
2024 年 12 月 18 日，来自美国华盛顿大学的 David Baker 教授（2024 年诺贝尔化学奖得主）在 Nature 发表研究论文「Four-component protein nanocages designed by programmed symmetry breaking」（图 1）。该研究探索了伪对称性机制设计的蛋白纳米笼如何实现对蛋白亚基的精准控制与组装。并通过基础结构设计、伪对称性单元开发、结构验证和功能测试，最终成功构建了高 T 数的蛋白纳米笼，包括四面体、八面体和二十面体的 T = 4 结构，为多抗原疫苗及靶向递送载体的开发提供了新的思路。
图 1 相关研究（图源：[1]）
自然界中的蛋白质纳米笼及其设计衍生体通常由一个或多个独特的组分组成，这些组分按照四面体、八面体或二十面体点群对称性进行排列。然而，在二十面体对称性中，病毒通过在十二个五边形亚结构之间插入若干六边形，从而实现更高三角化数（T 数）结构的构建，而不改变整体曲率。这种「对称性破缺」通常通过两种方式实现：一种是相同亚基以不同构象呈现（准对称性），另一种是采用相似但不同的亚基（伪对称性）。这种机制使病毒能够形成高 T 数的复杂结构，从而提升其功能。类似地，高 T 数蛋白质组装体的设计有望促进核酸递送技术的发展，并增强疫苗的免疫原性。然而，目前蛋白质设计虽然在对称性结构的设计上取得了显著进展，但实现具有多个非对称等价位置亚基的复杂结构仍面临巨大挑战。
基于上述背景，研究者开发了一种系统性策略，用于设计高 T 数蛋白质组装体。研究者选择伪对称性作为突破点，相较于准对称性，这种方法避免了设计单一亚基多重状态和交互界面的复杂性。他们提出的设计策略以 T = 1 的同源三聚体结构为基础，利用伪对称性异源三聚体替换部分界面，构建 T = 4 结构，并通过分步验证和扩展最终实现高 T 数笼状体的设计。研究者首先通过设计具有 C3 对称性的同源三聚体沿三重对称轴排列，构建基础 T = 1 笼状结构（图 2）。随后，他们提取了这些笼状结构中的关键亚结构（如五边形「冠状」结构），通过引入伪对称性异源三聚体消除某些特定界面，并重新设计异源二聚体界面以稳定这些子结构。最后，他们将这些「冠状」亚结构重新排列，配合其他对称性亚基，生成完整的 T = 4 四面体、八面体和二十面体笼状结构。
图 2 笼状结构设计策略（图源：[1]）
为实现纳米笼的设计策略，研究者需要构建一种可以替换同源三聚体的模块 —— 伪对称异源三聚体，每个亚基具有不同的氨基酸序列，从而在保持外部接口一致性的同时，保证了内部接口的差异性。利用既有的环状同源和异源三聚体设计，结合在三聚体末端刚性融合不同的螺旋重复蛋白片段，从而产生多样化的几何结构。这些设计在溶解性、单分散性和与理论模型的一致性方面表现出显著优势，并通过多种实验手段验证了其准确性，包括原位质谱、小角 X 射线散射和负染电镜等（图 3）。此外，研究者通过界面移植方法，在保留整体 C3 对称性的前提下，将异源寡聚体的界面整合至同源三聚体的亚基界面，成功构建了多个伪对称异源三聚体。这种方法能够有效拓展异源寡聚体的多样性，并广泛适用于其他对称蛋白寡聚体的设计。
图 3 伪对称异源三聚体设计与验证（图源：[1]）
紧接着，研究者通过 RPXdock 软件采样了 BGL17_A32 同三聚体 C3 轴沿三重笼形轴的旋转和平移位移，生成了 T = 1 的四面体、八面体和二十面体笼形结构。不同对称性下，最佳的重复单元数不同（分别为四面体、八面体和二十面体笼的 1.5、2.5 和 3.5 重复单元），这些设计能够与三聚体进行良好的形状互补。
接下来，研究者从结构确认的 T = 1 笼中提取了具有 C3、C4 和 C5 对称性的循环寡聚体（称为「冠」结构）。通过替换 BGL17_A32 同三聚体为结构相同的伪对称异三聚体 hetBGL0-18-17_A32，提取了不同的冠结构，并使用 ProteinMPNN 对设计模型进行筛选以避免形成自我相互作用。最后，研究者结合已获得的冠结构与 BGL17_A32 同三聚体，设计了 T = 4 笼。通过 RPXdock 采样了不同对称性下的最佳接口，并使用 ProteinMPNN 设计了序列，以确保最大化设计接口的稳定性，避免自我相互作用。通过 AF2 过滤筛选，获得了 14 组 T = 4 笼设计，分别为 TetT = 4-1 至 TetT = 4-5、OctT = 4-1 至 OctT = 4-4 和 IcoT = 4-1 至 IcoT = 4-5。四个组分分别在不同的 E. coli 培养中表达，混合并共同裂解后纯化，通过 NS-EM 分析确认了所设计的 T = 4 笼结构（图 4）。
图 4 nsEM 表征 T = 4 四面体、八面体和二十面体蛋白笼（图源：[1]）
David Baker 教授是生物化学领域的诺贝尔奖得主，同时担任霍华德 · 休斯医学研究所（HHMI）研究员以及华盛顿大学医学院蛋白质设计研究所（Institute for Protein Design）的主任。David Baker 课题组专注于开发蛋白质设计软件，并利用这些工具创造能够解决医学、技术和可持续发展挑战的分子。他近期的研究成果包括开发强大的机器学习方法，用于生成功能性蛋白质。David Baker 教授是美国国家科学院的当选院士，并荣获多项大奖，包括 2024 年诺贝尔化学奖，被《时代周刊》评为全球健康领域最具影响力的 100 人之一。
在 2022 年到 2024 年期间，David Baker 课题组发表了 23 篇 CNS（Cell、Nature、Science）论文，具体文章参考下方参考文献列表：
【2402】国内重点实验室分子生物学实验方法汇总（60 页）
【2403】2024 最新最全影响因子（20000+ 期刊目录）
