图解摘要
生物信息交流的调控依赖于核酸和蛋白质等生物大分子之间的相互作用与通讯。例如，基因表达的转录与翻译通过转录因子（TF）与 RNA 聚合酶或核糖体等蛋白机器协同实现信号的传递与放大。这些蛋白-蛋白通讯机制构成了生命功能的分子基础，并已在体外被成功模拟和重建。基于该机制的体外转录/翻译（TXTL）系统在生物传感、临床诊断、环境监测等领域展现出重要价值。然而，TXTL 系统的高复杂性限制了其实际应用，其依赖于多酶级联体系、多种辅因子及合成底物，且响应时间通常长达数小时，难以满足分钟级快速响应的现场检测需求。因此，开发全新设计的人工蛋白-蛋白通讯系统成为关键任务。近年来，随着生物化学和合成生物学的交叉发展，通过理性设计核酸底物及其化学修饰，人工分子通讯工具在重写蛋白质交互逻辑方面展现了巨大潜力。然而，目前的大多数人工蛋白通讯仍局限于「蛋白输入-蛋白输出」的模式，缺乏外源配体诱导的调控功能，这在一定程度上限制了其在生物传感和智能分子机器领域的广泛应用。
近日，湖南大学聂舟/雷春阳教授团队提出了一种配体响应的人工蛋白质-蛋白质通讯系统（ligand-responsive artificial protein-protein communication，LIRAC），有效解决了当前无细胞生物传感系统中普遍存在的天然转录翻译范式带来的系统复杂性和反应时间长的问题。通过合理设计嵌合 DNA 适配器（cDNA）并精确调控其与两种蛋白质的结合亲和力，实现了转录因子（TF）与 CRISPR/Cas 酶之间的快速高效通讯。LIRAC 利用配体调控 TF 的别构效应，将配体诱导的构象变化直接转化为 Cas 酶的快速单酶响应。相比传统的 TXTL 系统，LIRAC 大幅简化了反应体系，并将响应时间缩短至仅 10 分钟。通过构建便携式检测装置与试纸条，该系统成功实现了环境化学物质的快速分析，充分验证了其在环境污染物现场分析中的应用潜力。该研究成果发表在 Angew. Chem. Int. Ed. 期刊上，遴选为 VIP（Very Important Papper）论文，文章第一作者为课题组已毕业博士研究生王珂（现为空军军医大学药学系讲师）。
Scheme 1. LIRAC 系统与基于转录/翻译的传统的 NCIVT 系统对比。
(A) 传统的天然蛋白质-蛋白质通讯系统 NCIVT 的传感原理图，依赖于多酶级联体系、多种辅因子及合成底物，且复杂的转录/翻译过程耗时。(B) LIRAC 系统通过重新定义两类没有天然相互作用的转录因子（TF）和 CRISPR/Cas 酶之间的通迅，能够针对分析物进行快速检测，并通过设计双 TFs 与 Cas 酶的通讯，可构建三态逻辑门，实现多污染物的联合检测。此外，LIRAC 结合便携式检测设备与试纸条，为现场快速分析提供了高效解决方案。
图 1 评估转录因子对 Cas12a RNP（Cas12a/crRNA 复合物）活性的抑制作用。
为了实现 TF 与 CRISPR/Cas 酶之间的通讯，通过将 TF 结合位点与 CRISPR/Cas 酶识别序列整合来设计 cDNA。TF-cDNA 相互作用可能掩盖 Cas12a RNP 的识别区域，从而阻碍其激活。通过整合 TetR 结合位点（tetO）与 CRISPR/Cas 酶识别序列（包括 PAM、seed region 和 check point）来设计（cDNAI-cDNAIV），通过荧光 ssDNA 报告探针测试 TetR 结合对 Cas12a 附属切割活性的影响（图 1A 和 B）。在有无 TetR 的情况下，通过分析 cDNA 激活 Cas12a RNP 后 1 小时的荧光信号终点值，明确了 TetR 结合不同 cDNA 对 Cas12a 的影响，结果显示，cDNAII 和 cDNAIII 在加入 TetR 后，荧光信号分别降低 89.7% 和 79.2%，而 cDNAI 和 cDNAIV 受影响较小（图 1C 和 D）。选取抑制效果最佳的 cDNAII 继续后面的实验，在不同 TetR/cDNA 比值下测量 cDNAII 对 Cas12a RNP 附属切割活性的抑制效果（图 1E），进一步分析数据，发现当 TetR/cDNA 比为 20.7 时，可将 Cas12a RNP 的活性抑制 50%（图 1F）。
图 2 基于单分子荧光成像表征初步构建 LIRAC 系统。
为明确 TetR 对 Cas12a RNP 识别及结合 cDNA 的调控作用，采用全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRFM）进行单分子荧光成像（图 2A）。通过将 Cy3 标记的 cDNA 锚定于玻璃基底，同时以 Cy5 标记核酸酶缺陷型 Cas12a（dCas12a）RNP，实时监测两者的单分子结合事件（图 2B）。实验结果显示，在未处理的 cDNA 上，dCas12a RNP 结合形成的荧光共定位比率达到 56.2%，表明其高结合能力（图 2C）。但在 TetR 预处理的 cDNA 中，共定位比率显著下降至 7.9%，说明 TetR 结合 cDNA，对 dCas12a 的识别位点形成空间位阻的占位效应（图 2D）。进一步通过添加 TetR 的配体四环素（Tetracycline，Tc）恢复其构象，观察到共定位比率在 30 分钟内恢复至 48.8%（图 2E）。此外，共定位比率随 Tc 浓度呈剂量依赖性提升（图 2F），表明 Tc 诱导的 TetR 构象变化可有效激活 CRISPR/Cas12a 切割活性的功能。基于这些单分子实验结果，LIRAC 系统通过 cDNA 构建 TetR 与 CRISPR/Cas12a 的人工调控机制，成功构建了具有配体响应特性的蛋白-蛋白通讯系统（图 2 G），该研究结果为 LIRAC 系统在生物传感中的应用提供了数据基础。
图 3 基于 DNA 工程化解决 LIRAC 背景泄漏和实现动态调控。
作者通过 DNA 工程化调控 cDNA 和 Cas12a RNP 的结合亲和力（图 3A）。首先，通过设计串联的 tetO 位点来减少游离 cDNA 的比例（δcDNA），并结合 cDNAI 与 cDNAII，创建了新的 cDNA 构建体（cDNAI&II），从而增强了信背比（图 3B）。这一设计有效地降低了背景信号，将 LIRAC 系统的信噪比从 6.3 提高至 11.8，较原系统显著改善。进一步的优化通过引入诱饵 DNA（bDNA）作为竞争性抑制剂来增加 Cas12a RNP 的表观米氏常数（apparent Michaelis constant, Kmapp），从而减少背景泄漏。诱饵 DNA 包含 PAM 位点，可与 Cas12a RNP 竞争性结合，使其背景信号减少 73.8%（图 3C）。同时，bDNA 的浓度依赖性效应表明，在 100 nM 时，泄漏信号达到最小值（图 3D）。结合优化的 cDNAI&II 和 bDNA，LIRAC 系统的信噪比进一步提高至 36.9（图 3F）。此外，通过调节 TetR 浓度，发现 LIRAC 系统在不同 TetR/cDNA 比值下能调节灵敏度，表现出比传统体外转录系统更低的检测限，可达 0.013 µM（图 3 G）。
图 4 LIRAC 系统与传统 TXTL 和 IVT 系统在生物传感中的性能比较。
(A) TXTL、IVT 和 LIRAC 三种生物传感系统的工作机制使用的信号报告分子 —— 增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)、Pepper 荧光 RNA 和 FAM-TTATT-BHQ1 探针，分别在 qPCR 仪器上使用相同的 FAM 荧光通道进行同步分析，从而能够直接比较各系统的响应信号。(B) 三种系统的时间依赖性荧光信号变化显示，LIRAC 系统在 10 分钟内显著提高了荧光信号强度，且其响应速度明显优于 TXTL 和 IVT 系统。(C) 随着 Tc 浓度的变化，LIRAC 系统表现出最佳的动态荧光响应能力。LIRAC 系统能够在 10 分钟内检测到 0.1 µM 的 Tc，而 TXTL 和 IVT 系统需要更长的时间才能检测到较高浓度的 Tc。(D) 对比三种系统在响应时间和灵敏度方面的评估结果，LIRAC 系统在 10 分钟内的信号强度明显高于其他两种系统，即使在 Tc 浓度均为 1 µM 时，LIRAC 系统的信号强度也超过了 TXTL 和 IVT 系统在分别 2 小时和 1 小时后的信号强度，显示出 LIRAC 系统在快速响应和灵敏度方面的显著优势。
图 5 LIRAC 系统在多种分析物检测和多蛋白通讯中的应用与性能。
首先，LIRAC 平台通过优化 cDNA 序列，使其能够与不同的转录因子 (TFs) 结合，从而响应特定的目标物。例如，作者通过将 HosA 结合位点融入 cDNA 中，开发了一种用于快速检测防腐剂 p-HBA 的 LIRAC 生物传感法，能够对 p-HBA 做出快速且显著的信号响应 (图 5A)。此外，针对水中金属离子污染问题，LIRAC 系统通过采用铜特异性转录因子 CsoR，成功实现了对铜离子 (Cu(II)) 的高灵敏度检测，检测限低至 0.22 μM，远低于美国环保署 EPA 对自来水的标准 (20 μM)，表明 LIRAC 系统在水质监测中的潜在应用 (图 5B)。进一步地，LIRAC 系统展现出良好的选择性与高效的正交响应能力，数据显示不同的 TF 与 cDNA 的组合具有最低的交叉反应性和极高的特异性 (图 5C)。此外，为了增强 LIRAC 系统的功能，通过设计 cDNAI&III 变体构建了一个 OR 逻辑门系统，能够在任一输入 TF 存在时激活信号输出，证明 LIRAC 系统可以通过逻辑门设计实现多输入信号调控的潜力 (图 5D 和 5E)。进一步地，通过构建 LIRAC 系统的三态缓冲器，实现了能够根据不同输入信号调控输出的功能，三态缓冲器的设计包括高输出、低输出和高阻抗状态，展示了 LIRAC 在复杂信号调控中的潜力 (图 5F 和 5 G)。
图 6 基于 LIRAC 的便携式生物传感系统用于现场分析。
为了简化现场分析，并消除对复杂实验室设备的依赖，该课题组开发了一种与 LIRAC 生物传感系统兼容的便携式检测设备。该设备配备了微型荧光探测模块 (mFLD)，能够以低至 5 nM 的浓度检测 FAM 标记的 DNA(图 6A 和 6B)。使用该便携设备，LIRAC 系统在 5 分钟内即可快速检测到 0.5 μM 铜离子 (Cu(II))，而传统的 IVT 方法则需要更长的时间才能实现相似的检测 (图 6C)。进一步评估了该系统在环境水样中的铜离子检测能力。该系统与 ICP-MS 并行检测了含有不同浓度 Cu（II）的河水样本，结果显示两种方法环境水样的检测信号没有显著差异，证明了该系统在实际环境样品中的鲁棒性 (图 6D)。此外，LIRAC 系统与 ICP-MS 方法对比，Pearson 相关系数为 0.9927，表明两种方法的检测结果高度一致 (图 6E)，验证了 LIRAC 系统在环境水样污染物检测中的实用性。作者将 LIRAC 系统与侧向流试纸联合使用，用于检测化妆品中的对羟基苯甲酸酯 (Parabens)。这种系统利用酯酶将对羟基苯甲酸酯水解为 p-HBA，随后通过 LIRAC 系统检测 (图 6F)。结果显示，所有测试的对羟基苯甲酸酯在 100 μM 浓度下均触发了明显的荧光响应，并能通过侧向流试纸读取 (图 6 G)。该系统能够检测到低至 19.4 ppm 的对羟基苯甲酸酯浓度，显著低于典型的化妆品中浓度 (1400-8000 ppm)。此外，作者测试了 10 种来自国内外的不同品牌的护肤产品。这些样品通过荧光和侧向流试纸检测，结果表明其中五款产品含有对羟基苯甲酸酯，这与其标签成分一致 (图 6 H)，展示了 LIRAC 系统在化妆品安全检测中的可行性，为现场快速分析提供了新工具。
本研究建立了一种新型的配体响应型人工蛋白质-蛋白质通讯系统 ——LIRAC，旨在克服传统无细胞生物传感系统中存在的复杂性和响应时间长的问题。LIRAC 系统通过将非天然相互作用的转录因子（TF）与 CRISPR/Cas 酶连接，成功实现了高效、动态且快速响应的蛋白-蛋白通讯。作者通过设计嵌合 DNA 适配体，精确调控其与蛋白的结合亲和力，解决了以往研究中蛋白-蛋白相互作用不均匀、间接且多步骤的挑战。此外，LIRAC 系统通过引入配体介导的变构调控，将配体诱导的构象变化转化为 Cas 酶的快速响应，将反应时间从传统 TXTL 系统的数小时缩短至仅 10 分钟，显著简化了系统的复杂性，开创了快速响应的蛋白通讯系统新模式。LIRAC 系统展现了极高的灵敏度和可编程性，能够实现多种环境污染物的快速监测，并可通过构建三态逻辑门实现多重污染物的智能检测。基于其快速响应特性，进一步开发了便携式检测设备和试纸条，能够在现场对环境污染物进行快速分析。LIRAC 系统的模块化特性使其具有广泛的应用潜力，不仅可以应用于环境污染监测，还为基因编辑和生物传感等领域提供了全新的高效策略。
感谢合作者清华大学陈春来教授和周书棋博士、华南农业大学刘英菊教授和敖日其冷博士、中国科学院生态环境中心王丁一助理研究员在单分子实验、便携式装置搭建、3D 打印等方面给予的宝贵支持与协助。
通讯作者
聂舟，湖南大学化学化工学院教授、博导，研究生院副院长，生物大分子化学生物学湖南省重点实验室主任。先后入选国家万人计划青年拔尖人才，并曾获首届国家自然科学基金优秀青年科学基金，2017 年入选国家自然科学基金杰出青年科学基金。获湖南省优秀科技工作者、优秀研究生导师，卢嘉锡优秀导师奖，中国化学会青年化学奖，药明康德生命化学研究学者奖等。主要从事生命分析化学基础研究，围绕功能蛋白质和核酸的生物传感新方法开展系列工作，并取得重要创新成果。
雷春阳，教授，国家自然科学基金优秀青年科学基金获得者。主要从事基于酶分子工具创建的生物分析新方法研究，围绕酶分子及其底物开展理性分子改造，发展生物传感与生物分析新方法。
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202416671
