核基因组突变是多种疾病的根源，而线粒体作为细胞内具有半自主功能的细胞器，拥有独立的基因组，其基因组突变同样与多种遗传疾病密切相关。线粒体疾病通常累及多种组织器官，其中最为人熟知的包括 Leigh 综合征和 LHON（Leber 遗传性视神经病变）。Leigh 综合征的症状包括发育迟缓、肌张力减退、运动和呼吸障碍等，而 LHON 则表现为视力丧失、中央暗点和视神经萎缩等问题。根据 MITOMAP 的统计，目前已验证的线粒体致病性突变有 97 个，其中点突变占比高达 95%。然而，由于缺乏有效的点突变相关线粒体疾病小鼠模型，线粒体疾病的研究与治疗开发受到了严重制约。
早期的小鼠模型主要通过化学诱导或遗传工程构建[1]，但这些方法操作复杂、成本高昂且对突变的精准控制较差，仅成功建立了极少数模型。近年来，研究人员成功开发了线粒体碱基编辑工具，可以对线粒体 DNA 实现 C 到 T 和 A 到 G 的编辑，例如 DdCBEs 和 TALEDs。这些工具基于双链 DNA 脱氨酶 DddA 蛋白[2, 3]。虽然已有研究者尝试将这些工具应用于小鼠模型的构建，但其编辑效率尚不足以模拟人类线粒体疾病中高突变负荷的特征[4, 5]。此外，研究表明 DdCBEs 可能引发大量核基因组脱靶效应，这种非 TALE 依赖性的脱靶主要源于 DddA 蛋白的自组装以及其与 CTCF 的相互作用[6]。因此，基于 DddA 的线粒体碱基编辑工具在应用中面临核基因组脱靶的风险，难以直接建立线粒体突变与疾病表型之间的因果联系。
针对这一挑战，北京大学魏文胜课题组之前开发了 mitoBEs，这是一种结合切口酶与单链 DNA 脱氨酶的新型线粒体碱基编辑工具，能够实现线粒体 DNA 的 C 到 T 和 A 到 G 编辑。与 DdCBEs 和 TALEDs 相比，mitoBEs 展现出卓越的链特异性和显著降低的脱靶效应。得益于其双向碱基编辑能力，mitoBEs 能够对大约 87% 的致病线粒体突变进行精确建模[7]。
2025 年 1 月 22 日，昌平实验室及北京大学魏文胜课题组在 Nature 杂志在线发表了题为「Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs」的研究论文。该研究报道了通过优化后的 mitoBEs 实现高效且精准地构建线粒体疾病小鼠模型的成果。利用优化版 mitoBEs，研究团队成功建立了具有高突变频率的小鼠模型，这些模型表现出了与疾病相关的典型表型。此外，通过杂交实验，还获得了突变负荷达到 100% 以及仅含单碱基突变的精确小鼠模型。
为准确建立突变与疾病表型之间的直接联系，消除碱基编辑工具的脱靶效应尤为重要。在利用 mitoBEs 进行建模时，需要将 RNA 编码的 mitoBEs 注射到小鼠受精卵中。因此，该研究首先对 RNA 编码的 mitoBEs 系统的脱靶效应进行了全面评估。结果表明，RNA 编码的 mitoABE 存在广泛的转录组脱靶效应，而 mitoCBE 则表现出一定程度的依赖于 APOBEC1 蛋白的线粒体基因组脱靶效应。为了提高 mitoBEs 的精准性，该研究重点优化了脱氨酶。针对 mitoABE，通过突变筛选发现，TadA8e-V106W-V28F 能够显著降低转录组脱靶至背景水平（图 1）。针对 mitoCBE，筛选了多种现有的胞嘧啶脱氨酶，并发现 TadA 衍生的胞嘧啶脱氨酶 CBE6d 在线粒体基因组上表现出的脱靶效应接近背景水平。基于这些优化成果，研究团队将改进后的 mitoBEs 命名为 mitoBEs v2，包括 mitoABE v2 和 mitoCBE v2（图 1）。此外，该研究还系统性地评估了优化前后 mitoBEs 在核基因组上的脱靶效应，结果显示，无论是优化前还是优化后的 mitoBEs，均未在核基因组上引发明显的脱靶效应，从而验证了其在基因编辑中的安全性和可靠性。
图 1 优化 mitoBEs 的编辑精准性
通过将 85 个人类致病性线粒体 DNA 点突变与小鼠线粒体基因组进行同源性比对，研究确定了 70 个可编辑位点。进一步的细胞水平初步筛选成功实现了其中 68 个位点的编辑。比较发现，由环状 RNA（circRNA）编码的 mitoBEs v2 相比于 mRNA 编码的工具，具有更高的编辑效率。因此，研究团队将 circRNA 编码的 mitoBEs v2 注射至小鼠胚胎并进行移植，结果显示 mitoBEs v2 在多种 F0 代小鼠模型中均实现了较高的编辑效率，其中 mt-Nd5 A12784 G F0 小鼠模型的突变频率高达 82%（图 2）。此外，该研究系统性评估了 F0 代小鼠在线粒体基因组和核基因组中的脱靶效应，结果表明，在整个基因组范围内未检测到脱靶效应。这一发现表明，mitoBEs v2 能够构建遗传背景干净的线粒体疾病小鼠模型。更重要的是，线粒体基因组的编辑结果在小鼠不同组织中表现出广泛且持久的存在（图 2），并且能够通过母系遗传稳定传递。通过进一步杂交实验，研究成功获得了目标位点编辑效率达到 100% 以及仅含目标位点突变的 mt-Nd5 A12784 G 小鼠模型。
图 2 mitoBEs v2 高效构建线粒体疾病小鼠模型，编辑结果广泛且持久稳定于多组织
mt-Atp6 T8591C 和 mt-Nd5 A12784 G 分别对应人类线粒体致病突变 m.T9191C 和 m.A13379 G，并分别导致 Leigh 综合征和 LHON。研究团队对突变率较高的 F0 代小鼠进行了疾病表型评估，结果显示，mt-Atp6 T8591C 小鼠表现出显著的心脏功能障碍，与 Leigh 综合征的临床特征相符；mt-Nd5 A12784 G 小鼠则表现出类似 LHON 的视力障碍（图 3）。此外，研究还通过调整 TALE 结合位点，成功构建了仅含目标位点编辑的单碱基突变 mt-Nd5 A12784 G 小鼠模型。这些研究结果充分证明了 mitoBE v2 在创建线粒体疾病小鼠模型方面的高效性和精准性，为深入探索线粒体疾病的致病机制及开发新型治疗策略提供了重要工具。
图 3 小鼠模型呈现出相应的线粒体疾病表型
北京大学博士后伊宗裔为该论文的共同通讯作者，昌平实验室博士后张小雪为论文的第一作者，张雪、任纪武、李佳怡、魏晓旭和于莹博士也为该研究做出了重要贡献。本研究得到了昌平实验室、国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心及中国博士后科学基金的资助。
文章链接: https://www.nature.com/articles/s41586-024-08469-8
