基于平行人工膜模型的高渗工具药物筛选研究
来源
《中国新药杂志》 2024年 第33卷第22期
作者
关皓月，刘雪婧，黄韩韩，刘倩，张尊建，牛剑钊
中国食品药品检定研究院；
中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室
摘要
目的：本研究旨在建立以平行人工膜（parallel artificial membrane permeation assay，PAMPA）为模型的药物体外渗透性测定方法，筛选和验证高渗透性分类工具药物。
方法：采用μDissTM型光纤药物溶解渗透性测试系统和Caco⁃2细胞模型转运实验，结合PAMPA模型，对8种已知人体生物利用度数据的高渗透性模型药物进行了有效渗透速率（Pe）及表观渗透速率（Papp）的测定。筛选出适用于体内外渗透评估的高渗透性评价工具药物，并进一步应用于富马酸喹硫平（高渗透性药物）和卡托普利（低渗透性药物）的渗透性研究，以验证工具药物的适用性。
结果：8种模型药物通过PAMPA评价结果显示均为高渗[Pe（Papp）>10-6cm·s-1]且以被动转运为主要吸收方式（外排率<2）；本研究建立的PAMPA测定方法测得的5种药物Pe与文献报道的人体空肠Pe基本一致（相关系数0.9196）。
结论：研究表明，苯妥英、盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、米诺地尔5种药物可作为高渗分类工具药物。本研究结果为药物的渗透性评价提供了新的工具和方法，有助于药物高通量筛选以及渗透性评价。
关键词
渗透分类工具药物；平行人工膜；Caco⁃2细胞；有效渗透速率；表观渗透速率
正文 |
药物的渗透性是影响口服药物生物利用度的一个关键性因素，如何准确高效地评估药物的渗透性在药物的生产和质量管控中具有十分重要的作用。而基于生物药剂学分类系统（biopharmaceutical classification system，BCS）的口服固体速释制剂生物等效性豁免已经陆续得到WHO、美国FDA和欧洲EMA等的认可[1-2]。原国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administratio，原CFDA）于2016年颁发的《人体生物等效性豁免指导原则》也规定豁免的主要对象为BCSⅠ类（高溶解性、高渗透性）药物，且需提供药物高渗透性的数据支持[3]。
药物的渗透性可以通过人体药动学研究和渗透性测定方法获得。体外渗透性测定方法包括人体或动物体内试验和体外试验，其中体外试验包括：离体组织跨膜试验、单层上皮细胞试验和平行人工膜（parallel artificial membrane permeation assay，PAMPA）渗透试验法。对于动物在体肠灌流模型和体外细胞培养模型，《ICH协调指导原则———基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免（M9）》中推荐了近40种用于渗透性测定方法验证的模型药物，其中高渗透性（Fa≥85%）模型药物11种[4]。近年来，PAMPA模型越来越多地用于以被动转运为主的药物渗透行为的研究[5-8]，相比于其他体外模型，PAMPA可以更加低耗高效地测定被动转运药物的渗透性。Avdeef等[9]研究证实平行人工膜模型测定的药物渗透性结果与人体小肠灌流法测定的结果呈正相关，Bermejo等[10]对大量药物进行渗透性研究，发现PAMPA、大鼠原位肠道灌流和Caco⁃2的渗透性数据具有良好的相关性。
本研究以PAMPA模型为主，采用μFluxTM型药物渗透测试系统对模型药物（苯妥英、盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、米诺地尔、萘普生、酮洛芬、安替比林）进行渗透性测定，并加以Caco⁃2细胞模型数据辅助，与已有的人体吸收数据相比较，从中选出有代表性的药物作为高渗分类工具药物，并选用已知BCSⅡ类的富马酸喹硫平和BCSⅢ类药物卡托普利进行工具药物验证。
材料
1 仪器
μFluxTM型药物渗透性测定仪（Pion Inc）；MET⁃TLER S400⁃K酸度计（METTLER TOLEDO公司）、XPE26及MS1003TS型电子分析天平（Mettler Tole⁃do公司，精度：0.001mg，1mg）；MILLI⁃Q INTEGRAL型实验室超纯水系统（Merck Millipore公司）。
2 试药和试剂
胃肠道脂溶液（Pion Inc，批号：110669）；接收池漏槽条件缓冲液（acceptor sink conditioned buffer，ASB，Pion Inc，批号：110139）；人工仿生渗透膜（聚偏氟乙烯，0.45μm，Pion Inc，批号：120875）；96孔HTS transwell板（Corning公司，批号：3391）；DMEM培养基（Corning公司，批号：10⁃017⁃CV）；磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠、氯化钠均购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯；二甲亚砜（DIKMA公司，批号：R142109）；苯妥英对照品（批号：101187⁃201001，含量：100%）、盐酸普萘洛尔对照品（批号：101187⁃201001，含量：100%）、酒石酸美托洛尔对照品（批号：100084⁃201403，含量：99.9%）、卡马西平对照品（批号：100142⁃202207，含量：99.9%）、米诺地尔对照品（批号：100238⁃201702，含量：99.7%）、萘普生对照品（批号：100198⁃201706，含量：100%）、酮洛芬对照品（批号：100337⁃201104，含量：100%）、安替比林对照品（批号：100506⁃202003，含量：99.9%）、富马酸喹硫平对照品（批号：100815⁃201904，含量：99.7%）、卡托普利对照品（批号：100318⁃201904，含量：99.7%）均购自中国食品药品检定研究院。
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方法与结果
1 PAMPA法
利用PAMPA模型测定模型药物的有效渗透速率（Pe），实验装置见图1。装置分为供体室和受体室，中间由人工仿生渗透膜隔开，采用原位光纤紫外检测系统，利用原位光纤在线检测技术，实现药物浓度的实时监测。查阅大量文献，根据人体胃肠道内微环境的酸碱度，分别选用pH5.0，pH6.5，pH7.4的磷酸盐缓冲液模拟肠道内环境，作为供体室介质[11-13]；pH7.4的接收池漏槽条件缓冲液（acceptor sink conditioned buffer，ASB）模拟血液，作为受体室介质；中间的仿生膜代表胃肠道细胞膜，涂以胃肠道脂质体溶液。
1.1 溶液的制备
储备液的制备：用二甲亚砜分别将模型药物（苯妥英、盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、米诺地尔、萘普生、酮洛芬、安替比林）对照品稀释至一定的浓度，见表1。
供体室介质的制备：按《中华人民共和国药典》2020年版四部中缓冲液配制方法配置pH5.0，pH6.5，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
1.2 模型药物渗透性的测定
1.2.1 标准曲线的测定
将模型药物储备液分别用供体室溶液及受体室溶液稀释为浓度呈线性分布的稀释溶液。用光纤探头分别采集空白溶液以及待测药物稀释溶液（浓度由低到高）的紫外吸收光谱（见图2），用AU PROTM型软件（Pion Inc）二阶导数法校正后（见图3），以选定波长范围内矫正后的紫外图谱与横坐标围成的面积为横坐标，以浓度为纵坐标进行线性回归，标准曲线的线性相关系数（R2）需大于0.999，以证明具有良好的线性关系（见图4，以330~340nm卡马西平标准曲线为例）。
1.2.2 Pe的测定
取供体室溶液和ASB各20mL分别置于供体室和受体室，两室间以涂有胃肠道脂溶液的仿生膜隔离（仿生膜面积为1.54cm2）。取模型药物储备液适量（保证供体室内药物浓度低于该药物在水中的饱和溶解度，详见表1）置于供体室中，温度37℃，搅拌速度200r·min-1，采集时间3~8h，采样间隔60s，在200~720nm波长范围内，采用光纤探头分别测定药物浓度。按公式（1）计算药物的Pe：
式中：Pe为有效渗透速率（cm·s-1）；Ct为供体室中药物初始浓度（μg·mL-1）；dC/dt为受体室中药物浓度变化速率（μg·mL-1·min-1）；V为受体室中缓冲液体积（mL），A为膜面积（cm2）。
其中，以时间对测得的受体室中药物浓度进行线性回归，所得方程的斜率即为受体室中药物浓度的变化速率dC/dt。数据采集分析采用Au PRO软件（Pion Inc），二阶导数法校正后采用线性回归。
2 Caco⁃2细胞转运实验
2.1 细胞培养
将细胞培养基分别添加到Transwell的每孔中，在细胞接种前将HTS transwell板在37℃，5%CO2下孵育1h。用培养基将Caco⁃2细胞稀释成细胞悬液，将其分配到96孔板中。细胞在37℃，5%CO2，95%相对湿度的细胞培养箱中培养14~18d，每隔1d更换1次细胞培养基，计算测量跨单层的跨上皮电阻值（TEER），TEER值均>230ohm·cm2，证明Caco⁃2细胞单层质量良好。
2.2 储备液的制备
用二甲亚砜分别制备10mmol·L-1的模型药物和验证药物。
2.3 细胞转运实验及表观渗透速率（Papp）的计算
从培养箱中取出Caco⁃2细胞板并用预热的Hank’s平衡盐溶液（10mmol·L-1HEPES缓冲液，pH7.4）洗涤2次，在37℃下培养30min，并用预热好的Hank’s平衡盐溶液将各药物储备溶液稀释至5μmol·L-1。
确定从AP侧到BL侧的药物转运速率：将75μL的5μmol·L-1对照化合物和测试化合物的工作溶液添加到AP侧作为供给室，并将235μL的Hank’s平衡盐加入BL侧作为接收室（以上方法反向测得BL侧到AP侧的药物转运速率）。
将工作溶液转移到96孔板中，然后加入适量冷乙腈，在37℃孵育2h后，取细胞两侧样品转移到新的96孔板的孔中，然后加入4倍体积的冷乙腈。将样品涡旋，离心。取上清液与适当体积的超纯水混合后进行LC⁃MS/MS分析。药物在Caco⁃2单层Papp=细胞膜上的转运能力常用Papp来表示：
式中，dQ /dt 为单位时间药物转运量（μg·min-1）；A为Caco⁃2细胞单层膜的表面积（0.143cm2）；C0为供给室中待测物的初始浓度。
3 验证药物的渗透性测定
按“1”项下方法测定pH7.4介质中富马酸喹硫平及卡托普利的Pe。
按“2”项下方法测定pH7.4介质中富马酸喹硫平及卡托普利的Papp。
4 PAMPA法测定模型药物的Pe
4.1 标准曲线测定结果
各模型药物标准曲线测定结果见表2和表3，R2值均>0.999，线性良好。
4.2 模型药物的Pe测定结果
以卡马西平为例，待测药物在该方法下的Pe曲线见图5。从图中可以看出，药物随时间增长由供体室向接收室转移。
根据接收室中药物浓度⁃时间曲线的斜率，按公式（1）测得苯妥英、盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、米诺地尔、萘普生、酮洛芬、安替比林的Pe，采用EXCEL软件对数据进行计算分析，结果见表4。
每种模型药物在不同pH值介质中的渗透速率均重复测定3次，以3次实验结果的RSD判定本实验重复性，当RSD<10%时说明本实验重复性良好，结果见表5。另分别在不同日期对酒石酸美托洛尔在pH7.4介质中的Pe进行测定，采用IBMSPSS Statistics对实验结果进行t检验分析，以2次实验结果是否具有差异体现本实验的重现性，当P<0.05时判定差异有统计学意义，结果见表6。
每个模型药物3次实验的RSD均<10%，配对样品t检验结果显示两组数据差异无显著性（P>0.05），故PAMPA实验有良好的重复性及重现性。
5 模型药物在Caco⁃2细胞单层膜上转运的Papp
按“2”项测得苯妥英、盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、米诺地尔、萘普生、安替比林、酮洛芬的Papp及外排率（A/B），见表7。
6 富马酸喹硫平及卡托普利的Pe及Papp
以“1”项下实验方法在pH7.4的磷酸盐介质中测定富马酸喹硫平及卡托普利的Pe值，以“2”项下实验方法测定富马酸喹硫平及卡托普利的Papp值，结果见表8和表9。
讨论
1 PAMPA实验的验证
PAMPA模型作为一种仿生系统，可以快速测定被动转运机制吸收药物的渗透性，Avdeef等[14]做过研究，证明PAMPA法测定结果与人体小肠灌流法测定的渗透性结果呈正相关且相关性良好。将本研究通过PAMPA模型所得数据的对数值[logPe（7.4）]与Avdeef所得数据[logPm（7.4）]进行对比分析（见表10），采用SAS9.4对logPm（7.4），logPe（7.4）进行一元线性回归分析，拟合直线方程。
结果显示（见图6、表11），拟合直线方程为logPe（7.4）=-0.17823+0.99783×logPm（7.4），两变量之间的相关系数为0.9196，说明两变量之间呈现高度正相关。该模型对应的P值为0.0012（<0.05），一元线性模型回归效果显著。此外，模型对应的R2均>0.8，说明模型拟合效果良好。以此结果证明本研究所建立的基于PAMPA模型的药物渗透性测定方法具有可行性，且与人体数据相关性良好。
2 高渗分类工具药物的确定
通过Caco⁃2细胞转运实验中得出的药物外排率，可判断本研究中的药物均以被动转运为主要方式进行运输（外排率<2），符合PAMPA模型适用药物的要求。目前美国FDA等权威机构以及学者们对于高渗透性药物的界定：绝对生物利用度（Fa）不小于85%[3]和Pe（Papp）>1×10-6cm·s-1[14-17]，将本研究得出的数据与上述标准进行对比后可确定本研究中的模型药物均为高渗透性药物。
将模型药物的Pe及Papp与文献中这些药物的绝对生物利用度数据和人体的药物吸收数据（见表12和图7）进行比较，同时通过查阅文献[13-14，16]发现PAMPA模型下安替比林、酮洛酚及萘普生的渗透性均处于较低的范围[Pe（安替比林）为2×10-6cm·s-1；Pe（萘普生）为4.1×10-6cm·s-1；Pe（酮洛酚）为1.1×10-6]，而这3种药物的Fa及人体空肠Peff都处于较高的范围。并未有研究提供苯妥英及米诺地尔的Peff数据，但根据其Fa以及研究发表的Pe及Papp数据[13]（见表13），再结合本研究所测得的相关数据，可判断普萘洛尔、美托洛尔、卡马西平、苯妥英及米诺地尔属于高渗药物且适合本研究中的2种实验模型。
3 高渗分类工具药物的验证
已知BCSⅡ类药物富马酸喹硫平、BCSⅢ类药物卡托普利应分别属于高渗透性与低渗透性药物，将2种药物的Pe和Papp与本研究选出的分类工具药物（盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、苯妥英、米诺地尔）进行比较，发现富马喹硫平的Pe值（138×10-6cm·s-1）高于绝大部分工具药，而卡托普利的Pe值（0.81×10-6cm·s-1）则低于所有的工具药物，由此可体现分类工具药物的实用性与准确性。
4 结论
本研究最终选用盐酸普萘洛尔、酒石酸美托洛尔、卡马西平、苯妥英、米诺地尔为高渗透性分类工具药物，以便于更快捷、准确地确定药物的渗透性，可用于药物先导化合物的筛选及药物上市前处方研究，也可用于确定药物的BCS分类。
本研究填补了渗透分类工具药物应用领域的空白，确立了一套标准化的参考药物。通过将未知药物的渗透性测定结果与这些工具药物在一致的实验条件下的测定结果进行比较，能够迅速、准确地评估其渗透性水平。这一方法不仅为药物前期筛选提供了科学依据，也为药物开发提供了有力参考。
参考文献
详见《中国新药杂志》 2024年 第33卷第22期
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