首页时事民生政务教育文化科技财富体娱健康情感

旅行百科职场楼市企业乐活学术汽车时尚创业美食幽默美体文摘

PCR引物设计的12条黄金法则

创业 2025-01-22 10:34 浙江

文章来源于分子诊断实验室，作者研发小智

　

PCR（聚合酶链式反应）引物设计是分子生物学实验中的关键环节，其质量直接影响到PCR反应的特异性和效率。以下是PCR引物设计的12条黄金法则，这些法则基于广泛的实验经验和科学原理，旨在帮助研究人员设计出高效、特异的PCR引物。

1. 保守区设计

原则：引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

解释：保守区是基因序列中相对稳定、不易发生变异的区域，选择在保守区设计引物可以确保引物与目标序列的特异性结合，减少非特异性扩增的风险。

2. 长度适中

原则：引物长度一般在15~30碱基之间，常用的是18~27 bp，但不应大于38 bp。

解释：引物长度过短可能降低与模板DNA的特异性结合能力，而引物过长则会导致其延伸温度过高，不利于Taq DNA聚合酶进行反应。因此，选择合适的引物长度对于PCR反应的成功至关重要。

3. GC含量平衡

原则：引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

解释：GC含量过高或过低都会影响引物的引发效率。上下游引物的GC含量应保持一致，以确保它们具有相似的解链温度（Tm值）。Tm值是引物与模板DNA解链一半时的温度，它反映了引物与模板DNA结合的稳定性。适宜的Tm值有助于提高PCR反应的特异性和效率。

4. 避开密码子第三位

原则：引物3'端要避开密码子的第3位。

解释：如果扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因为密码子的第3位易发生简并（即多个密码子编码同一个氨基酸），这会影响扩增的特异性与效率。

5. 3'端选择

原则：引物3'端不能选择A，最好选择T。

解释：引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而当末位为T时，错配的引发效率大大降低。因此，为了提高PCR反应的特异性，引物3'端最好选择T。

6. 碱基随机分布

原则：引物中碱基的分布应尽可能随机，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶。

解释：聚嘌呤或聚嘧啶的存在可能导致引物在模板DNA上形成错误的结合位点，从而降低PCR反应的特异性。因此，在设计引物时，应确保碱基随机分布，避免出现连续的G或C。

7. 避免互补序列

原则：引物自身及引物之间不应存在互补序列。

解释：引物自身存在互补序列会形成发夹结构（Hairpin），这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板DNA的复性结合。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。这些都会降低PCR反应的特异性和效率。

8. ΔG值控制

原则：引物5'端和中间ΔG值应该相对较高，而3'端ΔG值较低。

解释：ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。选择5'端和中间ΔG值相对较高、而3'端ΔG值较低的引物有助于确保引物与模板DNA的特异性结合并防止非特异性扩增的发生。

9. 5'端可修饰

原则：引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰。

解释：引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以在5'端进行修饰以引入酶切位点、荧光标记等用于后续的实验操作。而引物的延伸是从3'端开始的，因此3'端不能进行任何修饰且不能有形成二级结构的可能。

10. 避开二级结构区域

原则：扩增产物的单链不能形成二级结构。

解释：某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响。选择扩增片段时最好避开二级结构区域。可以使用相关软件（如RNAstructure）预测mRNA的稳定二级结构，有助于选择合适的模板区域进行扩增。

11. 特异性检测

原则：引物设计完成后应进行BLAST检测，以确保其特异性。

解释：BLAST检测可以通过比对引物序列与已知基因序列数据库中的序列，评估引物与其他基因序列的相似性。如果引物与其他基因序列存在较高的相似性，则可能导致非特异性扩增。因此，特异性检测是确保引物有效性的重要步骤。

12. 综合考虑实验条件

原则：在设计PCR引物时还需综合考虑实验条件如退火温度、Mg²⁺浓度等。

解释：不同的实验条件可能会影响PCR反应的特异性和效率。因此，在设计引物时还需根据实验条件进行适当调整以确保PCR反应的成功进行。例如，可以根据实验条件调整引物的长度、GC含量和Tm值等参数以优化PCR反应条件。

文章来源于分子诊断实验室，作者研发小智

声明：本微信注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢。

IVD从业者网

体外诊断领域专业融媒体平台，专注行业价值资讯！链接医学检验新生态

最新文章

迈瑞首款核酸一体机获批！谁更慌？

刚刚，集采废标！历史首次

DeepSeek：17个IVD赛道的新年祝福！来了！

DeepSeek：2025年IVD行业7大发展趋势

领航、新羿，砸开了数字PCR的临床大门！

划时代！全球首款血流检测！数字 PCR 细菌四联检产品获批！

裁员的风，终于吹到了大厂

新产业年会，直接奖10万元！

他被裁了！

每年有30家左右IVD公司消失，今年得有300家！

IVD小发光，谁更强？

公司倒闭的前兆，能跑快跑，别想着过年了：如何搞垮一个团队

迈瑞医疗年终优秀员工，发金币！价值1W

突破！CRISPR-TB血液检测，结核游离DNA！

罗氏推临床质谱仪，“接棒” 赛默飞开启新战局？

罗氏诊断裁员赔偿曝光！！N+3

日赚6万+，这才是IVD职业经理人的天花板！

当下，正处于IVD行业的深度调整期！

科学家研发出新型病毒快检系统！

国家卫健委：必须开展的检验项目清单！

从年营收120亿，到亏损近10亿，达安基因的“疯狂”两年

三分钱“神药”背后的用药安全和疗效评估！IVD能做啥？

科华生物，2024预亏损6.5亿元

金域医学，2024年预亏损4.5亿元！

迈瑞全血流水线！进驻华西医院分院！

流式企业，指真生物，列入被执行人！

IVD行业现在还容易挣钱么？

2024年最热门的10个IVD产品领域！

都安全“乐轻检”，居家云检验平台火了！

从亏损1.8亿，到盈利200万，易瑞生物只用了1年！

接私单，入职几个月不出业绩！反复挣扎后，我开了好兄弟！

净利润1.75亿，增长60%！拱东医疗业绩预增！

中国城市艾滋病感染率排名！

新发突发呼吸道传染性病原微生物分级检测专家共识（2024）解读

最新！三甲医院检验科常见 300 个检测项目与临床意义

沃文特IPO终止！集采后，将很难翻身！

被罗氏“雪藏”近10年，Cobas Liat迎来高光时刻！再获一证！

卫健委发布！流感诊疗方案2025，弱化核酸检测，or规范？

呼吸道六联检废标3次！响应不足三家？

黄柏兴出手，任国内IVD企业营销总裁！

2024年，流感发病数858万人！

2024各大IVD企业，现状总结

分子诊断，还剩最后一次翻盘机会？

产品解析 | 第24期：QuantuMDx Q-POC 检测系统

30min，恒温PCR！融资14.5亿！脓毒症检测产品获批！“熬”出头了！

临床急需！罗氏诊断6款AD相关产品，优先审评！

天隆科技，一日下2证！

我阳了，但居家自检测不出来，就很凌乱！

国家卫健委：必须开展的检验项目清单！

被禁！高参数流式细胞仪之荧光光谱流式

分类

原创标签

时事社会财经军事教育体育科技汽车科学房产搞笑综艺明星音乐动漫游戏时尚健康旅游美食生活摄影宠物职场育儿情感小说曲艺文化历史三农文学娱乐电影视频图片新闻宗教电视剧纪录片广告创意壁纸头像心灵鸡汤星座命理教育培训艺术文化金融财经健康医疗美妆时尚餐饮美食母婴育儿社会新闻工业农业时事政治星座占卜幽默笑话独立短篇连载作品文化历史科技互联网

发布位置

广东北京山东江苏河南浙江山西福建河北上海四川陕西湖南安徽湖北内蒙古江西云南广西甘肃辽宁黑龙江贵州新疆重庆吉林天津海南青海宁夏西藏香港澳门台湾美国加拿大澳大利亚日本新加坡英国西班牙新西兰韩国泰国法国德国意大利缅甸菲律宾马来西亚越南荷兰柬埔寨俄罗斯巴西智利卢森堡芬兰瑞典比利时瑞士土耳其斐济挪威朝鲜尼日利亚阿根廷匈牙利爱尔兰印度老挝葡萄牙乌克兰印度尼西亚哈萨克斯坦塔吉克斯坦希腊南非蒙古奥地利肯尼亚加纳丹麦津巴布韦埃及坦桑尼亚捷克阿联酋安哥拉