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审阅︱陈 江，李崧
责编︱王思珍
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种复杂的神经退行性疾病，已成为全球老龄化社会的主要健康挑战之一。其病理特征包括细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑和细胞内过度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结。尽管AD的病因至今尚未完全阐明，科学界普遍认为Aβ和tau蛋白在疾病的发病机制中起到关键作用。然而，单一靶向Aβ或tau蛋白的治疗策略在临床试验中效果有限，提示AD可能涉及更为复杂的病理机制和调控网络。淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）作为Aβ的前体蛋白，已经在AD研究中被广泛关注。APP不仅在Aβ生成中起着中心作用，还参与了多种细胞过程，如突触功能调控、神经发育和细胞内信号传导。大多数研究集中在APP裂解后产生的产物，包括神经毒性的Aβ、神经营养的可溶性APP-α（sAPP-α）及APP的胞内片段（AICD）。然而，APP的N端结构域作为跨膜蛋白的重要组成部分，可能在病理进程中扮演未被充分重视的角色。近年的研究揭示，APP的N端结构域不仅能够与多种细胞外分子结合，还可能促进tau蛋白的胞内病理变化。课题组前期研究表明APP通过其N端与tau蛋白的结合，能够促进tau的胞内积累和病理性聚集，加剧神经元的突触功能障碍。近期研究中APP的N端突变，如Val225Ala（APPV225A），在临床病例中被发现与tau病理的加重和认知功能损害相关。尽管此突变位于远离Aβ编码区的N端，研究表明它能够通过改变APP的结构和功能显著影响其与tau蛋白的相互作用，进而促进tau蛋白的液-液相分离（LLPS）和病理性聚集。1、APPV225A突变增加APP和tau蛋白的亲和力
为深入探讨APPV225A突变对tau蛋白内吞的影响，课题组在SH-SY5Y细胞中进行了细致的实验分析。首先，通过生物素化标记实验，研究人员发现，与野生型APP相比，APPV225A突变显著加快了细胞膜上APP的内吞速率（图1c），表明该突变在细胞内转运中的活跃性增加。为了进一步验证这一发现，团队采用流式细胞术分析了用pHrodo标记的tau蛋白内吞情况。结果显示，APP^V225A突变细胞中内吞的tau蛋白量较野生型细胞显著增加，达到两倍以上（图1f）。此外，3D全息显微镜（Nanolive）进一步验证了这一观察结果，显示APPV225A突变细胞内的tau蛋白内吞现象更加明显，且在不同时间点上均高于对照组（图1d）。这些实验结果共同揭示了APPV225A突变不仅改变了APP结构，还增强了其与tau的结合及内吞，促进了tau蛋白的细胞内摄取。图1 APPV225A mutation increases the affinity between APP and tau proteins in the cell-free system2、APPV225A突变显著改变tau液-液相分离（LLPS）
为了深入理解APPV225A突变在tau蛋白液-液相分离（LLPS）中的作用，在无细胞条件下，将FITC标记的tau441与不同浓度的APPV225A共同孵育，观察到随着孵育时间的增加，APPV225A能够显著促进tau液滴的形成，呈现出浓度依赖性（图2a）。进一步的定量分析显示，相较于野生型APP，APPV225A突变诱导的tau LLPS更为显著，表明该突变加速了tau病理的早期阶段（图2b和2c）。为了验证这一现象是否在细胞环境中同样适用，研究团队将EGFP标记的tau441瞬时转染至表达APPV225A和野生型APP的SH-SY5Y细胞中。经过72小时的培养，结果显示，在表达APPV225A的细胞中，tau蛋白形成的液滴显著增加，并与APP蛋白共定位（图2f）。这一观察通过共聚焦显微镜和FRAP实验进一步确认，APPV225A显著改变了tau蛋白液滴的动态行为和内部分布（图2h和2i）。图2 APPV225A alters tau liquid-liquid phase separation in vitro3、APPV225A突变促进病理性tau形成，并导致hiPSC诱导的神经祖细胞（NPCs）和神经元中的突触损伤
为了研究APPV225A突变在hiPSCs来源的神经祖细胞（NPCs）和神经元中对tau病理和突触功能的影响，利用CRISPR-Cas9 RNP系统在hiPSCs中引入APPV225A突变。经过25天的培养和分化，结果显示，与野生型APP相比，APPV225A突变导致NPCs在tau441重组蛋白暴露后细胞形态显著变化，表现为细胞完整性和突触完整性的丧失，甚至在某些情况下引发细胞死亡（图3b）。在进一步分化至神经元的实验中（第50天），APPV225A突变对神经元的存活率也产生了负面影响，突变组神经元数量明显减少。然而，tau敲低能够部分恢复这些神经元的存活（图3c，左）。此外，APPV225A突变显著降低了突触标志物PSD95和SYN1的表达，而这种突触损伤在tau敲低后得到了逆转（图3c右，图3d）。Western blot分析证实，尽管APPV225A突变组神经元的APP蛋白水平稳定，但在tau敲低后，tau蛋白水平显著下降，显示出tau蛋白敲低的有效性（图3e）。通过50天分化的神经元的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）电生理记录进一步验证了这些发现。APPV225A突变导致mEPSC频率和幅度显著降低，显示了其对突触功能的破坏性影响，这与野生型神经元或tau敲低组神经元中未观察到的结果形成对比（图3f）。图3 APPV225A mutation promotes pathological tau formation and resultant synaptic damages in hiPSC-induced NPCs and neurons4、APPV225A突变增加p-tau231水平，并导致人类多能干细胞诱导的人类脑类器官中的神经元损伤
为了研究APPV225A突变在iPSCs衍生的脑类器官中引发的神经毒性和突触损伤，设计了一系列实验来揭示突变的多方面影响。首先，通过免疫荧光（IF）染色，确认了类器官的神经元分化和成熟标志物（如Sox2、Prox1、MAP2、TUJ1和Foxg1）的表达，验证了脑类器官内异质化的神经细胞群体（图4a）。形态学观察显示，APPV225A突变在类器官成熟阶段引起显著的形态学改变，突变组的脑类器官比野生型小，这种改变在tau敲低后得以逆转（图4b）。IF染色进一步显示，APPV225A突变显著提高了p-tau231水平，而tau敲低则降低了这一水平（图4c和4d）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，APPV225A突变导致突触密度显著减少，这一结果在tau敲低后得以改善（图4e和4f）。多电极阵列（MEAs）分析表明，APPV225A突变显著改变了脑类器官的电生理特性，表现为尖峰频率和放电率的显著降低，这些电生理变化同样可通过tau敲低来恢复（图4g-j）。Western blot分析确认了APP和tau蛋白的表达水平，验证了tau敲低的有效性（图4k和4l）。这些数据表明，APPV225A突变通过升高p-tau231水平，促使tau相关的神经毒性和突触损伤，导致脑类器官的显著结构和功能改变。图4 APPV225A mutation increases p-tau231 and resultant neuronal damages in human pluripotent stem cells-induced human brain organoids5、APPV225A突变改变tau液-液相分离（LLPS），并导致小鼠中的神经元损伤
为了验证APPV225A突变在活体小鼠模型中对tau病理和神经元损伤的影响，研究团队将携带hSyn-hAPPwt-EGFP-WPRE或hSyn-hAPPV225A-EGFP-WPRE的腺相关病毒（AAV9）注射到C57BL/6小鼠的海马区域。21天后，免疫荧光染色显示APP和tau蛋白在注射位置稳定表达。尽管Western blot分析未显示APPwt/tau和APPV225A/tau注射组之间的tau蛋白水平差异，免疫组织化学（IHC）染色却揭示APPV225A/tau组p-tau231水平显著升高，并通过免疫电子显微镜（IEM）观察到海马区域p-tau231的积累（图5b和5c）。进一步的分析表明，在hAPPV225A-EGFP和htauwt-mCherry共表达的小鼠脑组织中，tau呈现出类似神经原纤维缠结的变化（图5d），而在hAPPwt-EGFP和htauwt-mCherry共表达的小鼠中未观察到此现象。透射电子显微镜（TEM）和高尔基染色揭示APPV225A突变导致海马区域突触数量减少和树突棘密度显著降低（图5e和5f）。在CA3区域，突触标志物PSD95和SYN1的表达在APPV225A突变小鼠中显著下调，这一现象通过免疫荧光染色和Western blot分析得到验证（图5h和5i）。qRT-PCR分析也证实了这些突触标志物在转录水平上的表达下降（图5j和5k）。此外，APPV225A突变还显著降低了小鼠脑切片的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率和幅度，显示出对神经递质释放和突触功能的抑制（图5n）。在一系列抗体检测中，APPV225A突变特异性诱导了p-tau231水平的升高，而其他位点如Ser202/Thr205、Ser396和Thr181的磷酸化水平未见显著变化。图5 APPV225A mutation alters tau LLSP and resultant neuronal damages in the mice6、APPV225A突变对hiPSC衍生神经元中tau液-液相分离（LLPS）的交互组分析
为了揭示APPV225A突变在hiPSCs衍生神经元中对蛋白质相互作用和tau病理的影响，研究团队采用了MiniTurboID接近标记技术，以探索野生型APP和APPV225A突变型的N端区域（18-612aa）相关的交互组。该技术通过生物素化APP周围的近距离蛋白质，帮助识别可能与tau病理相关的分子环境（图6a）。通过将携带APPwt或APPV225A与MiniTurboID连接的慢病毒载体转染到神经元中，成功实现了细胞特异性的蛋白质标记（图6b），并通过Western blot验证了融合蛋白的生物素化（图6c）。接下来，研究团队对APPwt和APPV225A突变型神经元的交互组进行了比较分析。Venn图展示了两者交互组中独特和共享的蛋白质（图6d），揭示了V225A突变对APP与其他蛋白质相互作用的独特影响。功能分类分析表明，APPV225A主要与膜组织和蛋白复合体组装相关的蛋白质相互作用（图6e）。热图进一步量化了这些蛋白质的表达差异，提供了交互组改变的统计学相关性（图6f）。通过免疫沉淀验证蛋白质相互作用，进一步确认了接近标记实验的结果（图6g）。网络分析结合热图和验证实验的数据，揭示了APPV225A突变影响的功能通路，尤其与轴突和树突转运通路的显著关联，提示可能通过破坏tau稳态来影响神经元功能（图8h）。接近标记还鉴定出HS3ST3A1作为tau LLPS和磷酸化的重要调控因子，对APPV225A表达细胞中的tau病理起着关键作用。尽管CRMP1、SURF4、HS3ST3A1和DNM3不直接调控tau LLPS或磷酸化，它们可能通过参与突触功能和神经信号传导间接加剧tau病理。图6 Interactome analysis of APPV225A mutation impacting tau LLSP in hiPSCs-induced neurons by miniTurboID-based proximity labeling![]()
图6 working model本研究通过对细胞实验、hiPSCs衍生的脑类器官及小鼠模型的综合分析，首次揭示了APPV225A突变在阿尔茨海默病（AD）病理中的关键作用。研究表明，该突变通过增强APP与tau蛋白的结合，促进tau的液-液相分离（LLPS）和磷酸化，进而导致tau的异常聚集和突触损伤。显著的是，tau的敲低可部分缓解由APPV225A引发的病理改变，验证了APP突变在tau病理机制中的调控作用。这一发现强调了APP N端作为AD病理机制中关键区域的角色，并揭示其在AD发病中的独特贡献。本研究为APP N端突变在AD病理发展中的具体影响提供了新的视角，不仅进一步证实了APP在tau病理扩散中的重要作用，还展示了tau蛋白在APP突变导致的突触功能损伤中的核心地位。这些结果为AD的发病机制提供了新的理论框架，支持未来针对APP与tau相互作用的小分子抑制剂或其他靶向干预策略的开发。在未来研究中，应进一步探索APP N端的其他潜在病理性变异及其对tau病理和神经功能的影响。此外，研究APP与其他相关蛋白的互作如何影响AD病程及其他神经退行性疾病也具有重要意义。拓展这些研究将有助于更全面地理解AD复杂的分子机制，并推动新的疾病修饰疗法的开发。 综上所述，本研究为APP N端作为AD治疗潜在靶点提供了新证据，推动了探索多靶点联合治疗策略的可能性，具有显著的科学价值和临床应用前景。
尽管本研究在揭示APPV225A突变引发的tau病理机制方面取得了重要进展，但对于APP与tau相互作用如何在不同AD进程阶段发挥作用仍不够清晰。此外，本研究未能深入探讨其他可能影响APPV225A相关tau病理的潜在调节因子，这可能限制了对该突变全面作用机制的理解。未来的研究应在更广泛的生理和病理条件下验证这些机制，以确保研究结果的普遍性和临床应用价值。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41380-024-02837-6本文共同通讯作者为谭俊博士，浙大城市学院和贵州医科大学特聘教授；本文第一作者为浙江大学博士后陈江，共同第一作者为大连医科大学附属第一医院神经疾病研究所研究员李崧博士。转载须知：“逻辑神经科学”特邀稿件，且作者授权发布；本内容著作权归作者和“逻辑神经科学”共同所有；欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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