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责编︱王思珍
胃痛是一种常见的胃肠道症状，病因复杂。功能性消化不良、胃溃疡、胃癌和胃轻瘫都与胃部疼痛感觉有关[1-3]。胃痛患者进食受限，导致体重下降和生活质量下降[4-5]。传统观点认为胃痛的发生与胃动力异常、内脏敏感性增高和心身等因素有关，但具体发病机制尚不清楚，临床上缺乏特异性治疗方法。近年来，对内脏痛的研究取得了显著进展[6-9]。然而，过往对胃痛的研究主要集中在周围神经系统，对中枢神经系统机制的研究有限。临床上，迫切需要开发针对胃痛的新型特异性治疗方法。早期研究发现与胃解剖学相连的大脑核团的初步投射脑区[10-11]。然而，哪些脑区可以对胃痛刺激作出反应，以及它们如何形成神经环路来传递胃痛信号仍不清楚。近日，苏州大学徐广银/李锐团队在Nature communications杂志在线发表了题为“A vagus nerve dominant tetra-synaptic
ascending pathway for gastric pain processing”的研究论文。在这项研究中，研究者通过多种神经环路的研究方法、系统地研究了小鼠伤害性胃扩张（Gastric distension，GD）引起的胃痛的中枢神经传导回路。研究者发现孤束核（Nucleus tractus solitarius, NTS）是胃痛的一级中枢，主要通过迷走神经传入胃痛信号。前缘皮层（Prelimbic cortex，PL）参与胃痛的感知。外侧臂旁核(Lateral parabrachial nucleus，LPB）和丘脑室旁核（Paraventricular thalamic nucleus，PVT）是从NTS到PL的突触传递的关键中继脑区。谷氨酸能四突触NTS-LPB-PVT-PL回路对于胃痛的处理是必要且充分的。总的来说，这项发现揭示了NTS-LPB-PVT-PL谷氨酸能四级突触回路，它们通过小鼠的迷走神经传递胃痛感受信号。这项研究加深了人们对胃痛上行通路的了解，并为缓解内脏痛提供了潜在的治疗靶标。（拓展阅读：徐广银团队相关研究进展，详见姊妹号“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：；Neurosci Bull︱苏州大学徐广银/王谦团队发现丘脑连接核谷氨酸能神经元5-HT受体亚型介导慢性内脏痛；Neurosci Bull丨徐广银课题组揭示通过DNA甲基化靶向脊髓星形胶质细胞中GATA1与P2x7r结合以缓解内脏痛的新机制） ![]()
首先，研究者对6周龄小鼠进行胃气球植入手术诱发胃痛模型。手术后，对小鼠进行肩峰斜方肌肌电（EMG）记录以评估胃痛行为。为了探究大脑中与胃痛有关的核团，在伤害性GD后进行全脑c-Fos染色。研究发现，在雄性和雌性小鼠中，NTS、LPB、PVT和PL中的c-Fos表达水平是最高的。由于雄性和雌性小鼠的EMG活动和c-Fos表达水平没有显著差异，研究者接下来的研究主要在雄性小鼠中进行。NTS是内脏感觉传递的重要枢纽，但对其是否介导胃痛信号的传输尚不明确。因此，研究者通过注射表达增强型绿色荧光蛋白（HSV-EGFP）的顺行跨多级突触1型单纯疱疹病毒（HSV-1） H129到小鼠胃壁，来示踪顺行的神经投射。在病毒注射后，研究者观察到在结状神经节（Nodose ganglion，NG)和脊髓（Spinal cord，SC）中均有EGFP阳性神经元表达。在NTS、LPB、PVT、PL、中缝背核（Middle suture，DRN）、下丘脑室旁核（Paraventricular
nucleus of the hypothalamus，PVH）、下丘脑背内侧核（Dorsomedial
hypothalamic nucleus，DMH）、终纹床核（Bed nucleus of the
stria terminalis，BNST）和下丘脑外侧核（Lateral hypothalamus，LH）HSV表达水平最高。由于NTS能够接收来自迷走神经和脊髓神经的传导。为了研究NTS的胃源信号主要来自迷走神经还是脊髓神经传递，研究者在小鼠中进行了膈下迷走神经切断术（SDx）或T5水平胸脊髓横断术（T5x）。SDx组小鼠NTS中的EGFP表达几乎消失，而在T5x组小鼠中仍然观察到大量的 EGFP信号。此外，通过对以上两种手术后的小鼠进行c-Fos染色，也看到了一致的结果。以上这些数据表明NTS通过迷走神经对胃痛刺激作出反应，为鉴定胃痛信号在大脑中的上行通路奠定了基础。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）基于HSV示踪和c-Fos染色结果，研究者首先检测从NTS到PL的突触传递信号是直接投射还是间接投射。研究者将顺行示踪病毒AAV2/9-vglut2-EGFP注射到NTS，在PL中没有观察到神经末梢表达EGFP。为了进一步验证这一结果，研究者将逆行示踪病毒AAV2/Retro-mCherry注射到PL中，同样NTS中也没有mCherry阳性神经元。这些数据表明从NTS到PL没有直接神经投射。接下来，研究者进一步探究从NTS到PL存在多少级突触。研究者将顺行示踪病毒AAV2/9-vglut2-EGFP注射到NTS，在LPB和PVT中观察到EGFP+纤维显著表达。此外，将逆行追踪病毒 AAV2/Retro-mCherry注射到PL中会导致PVT中出现大量mCherry阳性神经元，但在LPB中则不会出现mCherry阳性神经元。接下研究则会采用顺行单突触示踪策略识别NTS-LPB神经通路，将scAAV2/1-hsyn-Cre病毒注射到NTS，并将AAV2/9-DIO-Ypet-mGFP病毒注射到LPB，研究者在LPB中观察到EGFP阳性神经元，并且这些神经元主要是谷氨酸能神经元。鉴定NTS-LPB突触后，研究者进一步探究LPB下游的脑区以鉴定出完整的通路。有意思的是，PVT中也存在mGFP阳性轴突末端的密集标记。为了进一步识别这种神经连接，研究者将顺行示踪病毒 AAV2/9-vglut2-EGFP注射到LPB，在PVT中结果观察到大量神经末梢。同样，将AAV2/Retro-mCherry注射到PVT，在LPB中观察到大量神经元。总的来说，这些数据表明从NTS投射到LPB的神经元表现出向PVT的顺行投射。然后，研究者利用双病毒策略，分别将scAAV2/1-hsyn-Cre和AAV2/9-DIO-Ypet-mGFP注射到LPB和PVT，在PVT中观察到大量mGFP阳性信号，同样mGFP标记的也是谷氨酸能神经元。同时，研究者观察到PL中神经末梢的强表达。与研究LPB-PVT相同的策略，研究者确定了从PVT-PL的投射，同样也是谷氨酸能神经元。这些数据表明这四个脑区之间存在突触连接，并且NTS-LPB-PVT-PL是谷氨酸能四级突触通路。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）为了进一步探究与NTS脑区中的胃痛相关的神经元类型，研究者使用神经元标志物进行染色。GD后NTS中激活的c-Fos阳性细胞主要是谷氨酸能神经元，而非GABA能神经元。体内光纤记录实验结果表明，对胃施加不同的压力刺激会引起NTSGlu中钙信号的激活。此外，为了研究NTSGlu对GD刺激的反应是通过迷走神经还是脊髓神经传递的，研究采用光纤记录联合SDx或T5x。与SDx之前的状态相比，当暴露于可比的胃压刺激时，观察到NTSGlu钙信号显著降低。相反，T5x后NTSGlu钙活性没有显著变化。为了探索NTSGlu在胃痛反应中的调节作用，研究者采用光遗传学来操纵NTSGlu的活性，并通过EMG记录来评估胃痛。黄光抑制NTSGlu可显著降低胃痛敏感性。蓝光激活NTSGlu加剧胃痛行为。此外，蓝光激活NTSGlu联合SDx后，胃痛反应显著减少。这些数据表明NTS中谷氨酸能神经元在迷走神经介导小鼠对胃痛行为的感知中发挥关键作用。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）接下来，进一步探讨LPB和PVT在响应胃痛信号中的作用。在GD刺激后，LPB中激活的增加得c-FOS阳性细胞主要是谷氨酸能神经元。体内光纤记录的结果表明，对胃施加不同的压力刺激会导致LPBGlu中钙信号的激活。为了探究LPBGlu在胃痛反应中的调节功能，研究者采用光遗传学来操纵LPBGlu活性，同时通过EMG记录来评估胃痛。蓝光激活LPBGlu加剧胃痛。黄光抑制LPBGlu可显著降低胃痛敏感性。采用相同方法，研究者进一步研究胃痛刺激激活的PVT神经元类型。GD后PVT中激活的c-Fos阳性细胞主要是谷氨酸能神经元。体内光纤记录实验结果表明，对胃施加不同的压力刺激会导致PVTGlu中钙信号的增加。蓝光激活PVTGlu加剧胃痛行为。黄光抑制PVTGlu可显著降低胃痛敏感性。这些数据表明LPBGlu和PVTGlu在小鼠对胃痛行为的感知中起着至关重要的作用。图4. LPB和PVT是NTS到PL的突触传递通路中的关键脑区。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）在PL中，GD刺激激活的大多数神经元是的谷氨酸能神经元。并且光纤记录的结果表明PLGlu响应不同压力的GD刺激而激活。同样，采用光遗传学联合EMG记录，观察到PLGlu的激活增加EMG信号，而PLGlu的抑制降低EMG信号，表明PLGlu在胃痛中的起到正向作用。为了研究PL中的胃痛信号是否通过迷走神经、NTS、LPB和PVT通路传递。研究者采用逐级验证的方法，在SDx后观察到PLGlu钙信号在响应GD刺激时显著降低，而在T5x后PLGlu钙信号没有明显改变。与对照相比，化学遗传学抑制NTS中的谷氨酸能神经元活性，导致PL中的c-Fos表达显著降低，在等效压力刺激下PLGlu钙信号显著降低。此外，在GD刺激期间化学遗传学抑制LPB神经元，显著降低了PL中的c-Fos表达和谷氨酸能神经元钙信号。同样，化学遗传学抑制PVT谷氨酸能神经元活性也显著降低了GD刺激期间PL中的c-Fos表达和谷氨酸能神经元钙信号。这些数据表明，胃痛信号通过迷走神经传递到NTS、LPB和PVT，并最终到达PLGlu以感知胃痛反应。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）接下来，研究者进一步探究这种NTS–LPB–PVT–PL谷氨酸能通路路（NTSGlu–LPBGlu–PVTGlu–PLGlu）是否可以调节胃痛行为。由于这是一条四级突触连接通路，研究者逐个突触地确定两个核团之间的功能。研究者最先确定投射到LPB的NTSGlu神经末梢在胃痛调节中的作用。光遗传学激活投射到LPB的NTSGlu神经轴突末梢显著增加了EMG信号，而光遗传学抑制投射到LPB的NTSGlu神经轴突末梢显著降低EMG信号。接下来，研究者使用相同的方法确定了LPB-PVT和PVT-PL这两级通路在胃痛调节中的作用。综上，这些数据表明NTS-LPB、LPB-PVT和PVT-PL神经通路在调节胃痛中的作用。研究者还检测了NTS-PVT神经回路在调节胃痛中的作用。无论是激活还是抑制NTS-PVT神经通路，都不会改变EMG信号。此外，环路示踪技术显示，从NTS到PL没有直接投射，也没有从LPB到PL的直接投射。图6. NTS-LPB、LPB-PVT和PVT-PL通路对于调节胃痛信号至关重要。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）由于这是一条四级突触连接通路，研究者接下来使用cre依赖的化学遗传策略和微量灌注给药并联合EMG记录确定它们作为三个核团之间的两个突触的功能。与对照相比，通过微量灌注给药CNO到PVT，化学遗传学抑制NTS-LPB-PVT回路可显著降低小鼠对GD的EMG信号。类似地，微量灌注给药CNO到PL，化学遗传学抑制LPB-PVT-PL回路可显著降低小鼠对GD的EMG信号。这些数据表明，NTS-LPB-PVT和LPB-PVT-PL神经通路路在调节胃痛中发挥作用。由于谷氨酸能神经元在该回路中起着关键作用，因此研究者使用荧光探针联合化学遗传学，来操纵四突触神经回路并检测GD期间的谷氨酸释放。将scAAV2/1-hsyn-Cre注射入NTS，将AAV2/Retro-vglut2-DIO-hM4Di-EGFP注射入PVT，将AAV2/9-hsyn-iGluSnFR注射到PL，并将套管植入LPB。通过向LPB微量灌注CNO实现对该回路的特异性抑制。与对照相比，GD刺激期间PL中谷氨酸释放显着减少。雌性小鼠中观察到类似的结果。这些结果进一步支持了在NTS-LPB-PVT-PL神经回路中，谷氨酸能神经元将GD诱发的胃痛信号从胃传递到大脑中发挥重要作用的观点。综合以上数据表明，谷氨酸能NTS-LPB-PVT-PL通路对于调节胃痛是必要且充分的。
图7. NTS-LPB-PVT和LPB-PVT-PL通路对于调节胃痛信号很重要。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）
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图8. 迷走神经主导的胃痛处理上行通路的工作模型。（图源：Zhang et al., Nature Communications, 2024）这项研究对胃痛信号传递的整个上行通路进行了探索。研究发现GD刺激小鼠引起胃痛后，NTS、LPB、PVT和PL脑区内激活的神经元数量显著增加，功能研究进一步证明NTS、LPB、PVT和PL内谷氨酸能神经元的钙活性增强。通过逐步地深入研究，研究者确定了NTS–LPB–PVT–PL谷氨酸能的四级突触神经环路是调控胃痛的充分必要条件。并且通过多种功能验证实验，研究发现NTS–LPB–PVT–PL谷氨酸能四级突触神经环路主要通过对迷走神经传入信号的调控来调节胃痛信号的传递。总的来说，这项研究以胃痛为例，确定了胃痛存在一条上行通路，将外周器官痛和中枢神经系统系统地联系了起来，对于将来深入研究胃-脑轴，特别是胃痛感知的信号通路提供了参考，并为胃痛的干预治疗提供了多个中枢神经系统的潜在治疗靶点。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54056-w转载须知：“逻辑神经科学”团队原创性内容，著作权归“逻辑神经科学”所有，欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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1. Enck, P. et al. Functional dyspepsia. Nat. Rev. Dis. Prim. 3, 17081 (2017).2. Grover, M., Farrugia, G. & Stanghellini, V. Gastroparesis: a turning point in understanding and treatment. Gut 68, 2238–2250 (2019).3. Wang, H. J. et al. Epigenetic upregulation of acid-sensing ion channel 1 contributes to gastric hypersensitivity in adult offspring rats with prenatal maternal stress. Pain 161, 989–1004 (2020).4. Stanghellini, V. et al. Gastroduodenal disorders. Gastroenterology 150, 1380–1392 (2016).5. Chang, L. et al. Gender, age, society, culture, and the patient’s perspective in the functional gastrointestinal disorders. Gastroenterology 130, 1435–1446 (2006).6. Li, Y. C.,Wang,Q., Li,M. G., Hu, S. F. & Xu, G. Y. A paraventricular hypothalamic nucleus input to ventral of lateral septal nucleus controls chronic visceral pain. Pain 164, 625–637 (2023).7. Xu, Q. Y. et al. Identification of a glutamatergic claustrum-anterior cingulate cortex circuit for visceral pain processing. J. Neurosci. 42, 8154–8168 (2022).8. Zhang, F. C. et al. Paraventricular thalamus-insular cortex circuit mediates colorectal visceral pain induced by neonatal colonic inflammation in mice. CNS Neurosci. Ther. 30, e14534 (2023).9. Chang, X., Zhang, H. & Chen, S. Neural circuits regulating visceral pain. Commun. Biol. 7, 457 (2024).10. Rinaman, L. & Schwartz, G. Anterograde transneuronal viral tracing of central viscerosensory pathways in rats. J. Neurosci. 24, 2782–2786 (2004).11. Horn, C. C. et al. Delineation of vagal emetic pathways: intragastric copper sulfate-induced emesis and viral tract tracing in musk shrews. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 306, R341–R351 (2014).
