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本文以研究油浴仪法测定 D 值的影响因素为目的，采用残存曲线法多次测定同一批嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值，根据不同条件下 D 值测定结果的比较，确定 D 值测定的影响因素。通 过比较 0.05 mL、0.5 mL、1.0 mL 三种菌液量，以及毛细管、安瓿瓶两种分装方式的测定结果发现，安瓿瓶分装 0.5 mL 菌液 6 次测定 D 值均在标示 D 值的 80％～ 120％之间，测定结果准确稳定。因此，本文建议油浴仪测定 D 值时将菌液分装在安瓿瓶中，每瓶分装 0.5 mL，并关注油浴仪温度的均匀性和稳定性。
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在湿热灭菌工艺中，可以通过检验生物指示剂灭菌后的存活情况来验证灭菌效果 [1-5]。生物指示剂是指将特殊活微生物采用特定方法制备成对特定灭菌工艺有耐受性的一种生物制品，一般选用比普通微生物有更强耐受性的微生物[4]。生物指示剂目前主要有三种类型：芽孢悬液型、自含式、载体型生物指示剂 [6-10]。
评估生物指示剂的关键技术参数主要有总芽孢数、D 值。总芽孢数即产品存活孢子数。D 值指在一定暴露条件下，将试验微生物杀灭 90% 所需的灭菌时间 / 剂量 [11-13]。D 值越大说明微生物死亡速率越慢，耐热性也越强。D 值会受到菌种、细菌或芽孢菌悬液的性质、 灭菌温度 / 剂量影响，不受初始细菌数量的影响。
D 值在灭菌设备的性能确认、特定灭菌工艺的开发、生产过程灭菌效果的检测及评估方面具有重要作用。检测 D 值的方法主要有阴性分数法和残存曲线法 [14]，测定的 D 值应在标示 D 值的 80％～120％之内。
为验证拟定的灭菌工艺是否能让产品达到要求的无菌保证水平，本研究以油浴仪测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值为例，分析油浴过程并确定关键点，建立油浴仪残存曲线法测定 D 值方法，测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值，并根据试验结果指导产品灭菌工艺生物学挑战验证。
材料
表 2 试验样品
表 3 培养基
表 4 仪器
方法与结果
图 1 油浴仪结构图
讨论
3.1 D 值测定结果分析
根据油浴仪残存曲线法 D 值测定结果分析，由表 8 可知：采用 0.5 mL 菌液体积的试验，测定 D 值为标示 D 值的 91%、119%、110%、 111%、115%、113%，均在标示值的 80% ～ 120% 之间，而采用 0.05 mL 菌液体积测定 D 值为标示 D 值的 124%、148%，采用 1 mL 菌液体积测定 D 值为标示 D 值的 145%、156%， 均未在标示 D 值的 80% ～ 120% 之间。因此采用 0.5 mL 菌液体积进行 D 值测定较好，测定 D 值更准确。
3.2 不同菌液量之间的比较
不同的菌液体积影响了菌液的分装载体，0.05 mL 菌液体积采用毛细管分装，0.5 mL 和 1 mL 菌液采用安瓿瓶进行分装。①样本用量比较：采用毛细管进行 D 值测 定，每组样品≥ 6 支，安瓿瓶每组样品≥ 4 支，在分装次数上安瓿瓶分装次数少于毛细管，但总体积为毛细管最少。②分装方法比较：毛细管采用注射分装体积，分装时针头需伸入毛细管中，而安瓿瓶采用移液器进行分装，因此采用安瓿瓶分装比毛细管分装更简便。③载体比较：载体不同也会对样品孢子回收率产生影响，毛细管体积少，回收困难，回收率低。④油浴温度的影响：菌液体积越大吸收的热量越多，对油浴温度的影响也越大，对样品的灭菌效果出现较大的影响。
3.3 仪器性能对于 D 值测定的影响
影响测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中 D 值的主要因素为温度、时间，而其中温度对于灭菌效果的影响非常显著。采用油浴仪进行 D 值测定，油浴仪对温度稳定控制较弱，采用循环管道平衡各位置的温度，受循环泵和硅油流动速度的影响，油浴仪各位置温度均一性较差。由于油浴仪内的样品放置的位置不同，因此每个样本所处位置的温度不完全一致，放入样品后，吸收热量导致局部温度出现下降， 灭菌效果下降，可能会对测试结果有一定影响。这也可能是上述实验结果中测定的 D 值均比标示 D 值大的原因之一，真实值比测定值小，出现误差。因此，测定 D 值所需的硬件设备对于 D 值测定准确性至关重要。
撰稿人 | 申景丰 蒋芙蓉 汤平 余卫国 夏博 陈超
责任编辑 | 邵丽竹
审核人 | 何发
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