酶在合成生物学和生物催化领域引起了相当大的关注，被广泛认为是光活性化学物质生物合成的首选。酶的复杂立体化学结构往往表现出独特的空间、疏水和静电性质，特别是在活性中心内，形成了高立体选择性的基础。然而，酶面临着保持高立体选择性的挑战，特别是当面对具有几乎对称结构的底物时。这些底物通常被认为是“难以区分的”，不仅是化学催化剂，而且是生物催化剂。手性环己-3-烯-1-羧酸（CHCA, P1）具有几乎对称的六原子环，是合成多种药物、农用化学品和天然产品的重要组成部分。与环己烷、环己二烯和苯基相比，P1由于其独特的环己烯结构，往往表现出独特的生物活性。P1的对映体对展示了适用性，两种对映体都是通用的构建块。例如，(S)-P1被用于合成Edoxaban， Edoxaban是一种有效的口服药物，通过抑制凝血因子Xa治疗静脉血栓形成和手术出血。相反，(R)-P1构成了奥司他韦的关键组成部分，奥司他韦是一种广泛使用的口服抗病毒药物，通过抑制神经肽糖苷酶来治疗甲型流感。由于(S)-和(R)- p1的结构相似，只有C=C远离手性中心的位置存在微小差异，因此区分(S)-和(R)- P1对于化学和生物催化剂来说都是具有挑战性的。
目前合成手性P1的化学方法涉及繁琐的分解步骤，需要大量的手性试剂和有害的有机溶剂，导致低原子经济性和环境问题。手性P1的生物催化合成有其自身的挑战。具有不同取代基大小的非对称酯相对容易被底物结合袋区分，它排除了由于位阻或不利的排斥力而产生的不相容构型。然而，区分几乎对称的P1酯对于底物结合袋来说是具有挑战性的，因为(R)-和(S)-酯之间的差异很小。商用酶如Novozym 435和猪肝酯酶（PLE）在区分(S)-和(R)-P1酯方面没有选择性。据报道，羧酸酯酶BioH对P1酯具有活性，但其低E值仅为2.1，需要反复构建三重突变体，导致在40 mM底物浓度下E值增加到7.1。然而，进一步的浓度增加导致立体选择性显著降低。因此，手性P1和酯的对映选择性合成仍然是一个巨大的挑战，给化学和生物催化剂都带来了困难。
WT， DR3和DS6的底物结合袋方案与互补对映体选择性和使用QM/MM计算的自由能势垒分析（图源自Nature Communications ）
定向进化在加速立体选择酶的发展中起着关键作用，采用了多种策略，分为数量密集型和质量密集型方法。数量密集型策略涉及整个序列空间的随机突变。这种方法需要可靠的高通量筛选（HTS）方法，理想的通量超过1×107个突变体/天。然而，在HTS中使用显色或电子底物类似物可能偏离研究目标，特别是在发展催化活性，对映体选择性和底物特异性方面。质量密集型方法侧重于利用限制性遗传密码子进行理性或半理性诱变，以构建“智能库”。识别潜在热点对这些方法至关重要，通常通过经验、实验或计算分析来确定。虽然质量密集型方法是有效的，但在处理“难以区分”的基材时，它们可能面临挑战。
机器学习（ML）作为一种替代方案出现，为促进基于大量高质量数据和统计模型的定向进化提供了更直接的捷径。机器学习是数据驱动的，可以识别催化模式，预测有希望的突变体，并擅长预测定向进化的新替代组合。ML已被用于控制各种酶的活性、热稳定性和立体选择性，包括环氧化物水解酶、亚胺还原酶、P450单加氧酶和转氨酶。ML预测器的成功取决于训练数据集的质量，Ran等人最近的研究表明，在预测非对称底物水解酶的对映体过量比例方面有希望，28个反应中有18个反应得到了积极的预测。正预测率为64%，这可能是由于水解酶催化的动力学分辨反应数据质量较低，在接近对称底物的情况下预测率较低。因此，生成高质量的数据集和选择合适的描述符是ML预测器成功的关键。
研究提出了一种高通量方法，利用“真正的底物”环己基-3-烯-1-羧酸乙酯（CHCE, S1），以其几乎对称的结构为特征，生成来自不动杆菌sp. JNU9335的羧酸酯酶AcEst1的高质量数据集。随后，利用从AcEst1的生化考虑中提取的特征构建了一个ML预测器。然后将训练好的ML预测器应用于设计组合突变体。最后，研究成功地实现了AcEst1的立体发散进化，从而产生了两个立体互补突变体。这些突变体进一步用于手性S1的两种对映体的合成。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-53191-8
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