大家好，今天给大家分享一篇发表在Nature Methods上的文章：Influence of different sample preparation approaches on proteoform identification by top-down proteomics，通讯作者是德国基尔大学的Andreas Tholey教授，他的研究方向主要聚焦于开发基于质谱的生物分子分析方法。在这篇文章中，作者对自上而下蛋白质组学的不同样品制备流程进行了系统性研究。
与将蛋白质消化为肽段进行检测的自下而上的蛋白质组学相比，自上而下的蛋白质组学（TDP）鉴定完整的蛋白质形式，因而可以揭示蛋白质组完整的复杂性。然而目前，TDP在样品制备、蛋白质分离、质谱分析和数据库搜索等各个阶段仍然面临很多挑战。其中，作者关注到目前已经报道了各种TDP样品制备流程，它们在细胞裂解、样品净化、分离和纯化合适质量的蛋白质形式等步骤上各有不同。因此作者希望评估这些样品制备方案对蛋白质形式鉴定的影响。于是作者首先构建了合适的LC-MS/MS工作流程，以公平比较各种TDP样品制备步骤。接着，作者研究了各种裂解溶液对TDP蛋白质鉴定的影响，包括磷酸盐缓冲液（PBS）、碳酸氢铵-尿素（Urea-ABC）、盐酸胍（GndHCl）、十二烷基硫酸钠-Tris（SDS-Tris）、含氯化钠的酸性乙腈水溶液（ACN-NaCl）和三乙基碳酸氢铵乙腈水溶液（ACN-TEAB）。结果显示，不同裂解体系在蛋白质形式的鉴定数目上存在差异，GndHCl和ACN-TEAB裂解后可以鉴定到最多的蛋白质形式。而对鉴定到的蛋白质理化性质进行分析，作者发现不同的裂解体系也会在蛋白质的分子量和等电点上存在偏好。然后，作者研究了半胱氨酸的还原烷基化对蛋白质鉴定的影响，发现对样品进行还原或还原烷基化后，鉴定到的含半胱氨酸的蛋白质数量显著增加。进一步，作者对各种蛋白质富集、分离和纯化策略进行了研究，包括凝胶洗脱液相组分截留电泳（GELFrEE）、截留分子量（MWCO）filter、C18固相萃取（SPE）、酸性ACN耗竭、基于丙烯酰胺凝胶的预分馏（PEPPI）和体积排阻色谱（SEC），以及不做处理直接进行LC分离（1D-LC）作为对照。结果显示，高达56%的蛋白质形式仅在一种方法中被鉴定到，而仅有4%的蛋白质形式同时被7种方法一起鉴定到，说明不同策略之间存在高度互补性。后续作者也比较了不同策略鉴定的蛋白质理化性质，并总结了选择不同策略的决策树。总的来说，这篇文章中作者系统研究了不同样品制备流程对自上而下的蛋白质组学鉴定的影响，可以为自上而下的蛋白质组学制样流程的选择提供指导。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02481-6文章引用：10.1038/s41592-024-02481-6
