Nat. Methods | 寡核苷酸介导的邻近标记策略（O-MAP）表征RNA微环境的多组学特征
学术
2024-11-09 20:02
北京
大家好，本周推荐一篇发表在Nature Methods的论文，题目为“Multiomic characterization of RNA microenvironments by oligonucleotidemediated proximity-interactome mapping”，通讯作者是华盛顿大学的David M. Shechner教授，David M. Shechner课题组专注于开发前沿的合成生物学、化学生物学和基因组学工具研究RNA的空间细胞生物学。在细胞的背景下，几乎没有RNA是裸露的。RNA与蛋白质、其他RNA和基因组位点之间的直接相互作用调控着RNA生命周期的各个方面，包括生物合成、定位、降解及其编码或非编码功能。RNA与微环境之间的相互作用对于理解其功能至关重要。然而，这些相互作用网络在原位检测上存在一定的困难。这项工作发展了一种寡核苷酸介导的邻近标记策略（O-MAP），该方法无需遗传操作，用于在保持微环境的情况下阐明目标RNA附近的相互作用分子。O-MAP方法的具体流程如下：首先，待分析的样本经过固定处理，接着未经过化学修饰的寡核苷酸探针与目标RNA进行退火杂交。在寡核苷酸探针的一端附加通用富集序列，以便在随后的步骤中招募一个结合HRP（辣根过氧化物酶）的通用次级寡核苷酸。当添加生物素-酪酰胺和过氧化氢后，HRP催化生成高度反应性的苯氧基自由基。这些自由基能够向外扩散，并对目标RNA附近（约10-75nm）的分子进行广泛的生物素化，从而实现对这些分子的富集。基于该策略，O-MAP方法在靶向47S和7SK RNA时，分别实现了显著且精确的核仁和核质生物素化，背景几乎不可检测，表明其高灵敏度和特异性。此外，作者还将该方法与APEX2进行了比较，O-MAP在空间分辨率上显著优越，避免了非特异性标记的问题。作者通过实验确认了O-MAP与FISH技术完美兼容，O-MAP能有效标记低丰度RNA，且与RNA-FISH信号完全共定位。接下来，研究团队开发了一系列工具（O-MAP-MS、O-MAP-seq、O-MAP-ChIP）用于在目标RNA的微环境中发现相互作用的蛋白质、转录本和基因组位点。首先作者使用47S O-MAP靶向核仁，7SK O-MAP靶向核质，经过富集后采用TMT定量策略成功捕获了一系列高度相关的核仁和核质蛋白。另外，为了证明O-MAP-MS在研究低丰度RNA的有效性，研究者选择了lncRNA Xist作为模型。Xist在女性细胞中负责X染色体失活，形成特定的异染色质结构。研究团队在小鼠“Patski”细胞中应用了优化的O-MAP探针和生物素化条件，以捕获Xist结合的蛋白质。结果显示，O-MAP-MS成功捕获了已知的Xist相互作用蛋白，富集效率明显高于传统方法。分析表明，O-MAP-MS不仅捕获了直接的Xist相互作用因子，还揭示了Xist的局部微环境，从而绘制出Xist区域的蛋白组图谱。为了扩展O-MAP技术的应用，作者也开展了转录组分析和基因组分析，以绘制与目标RNA相邻的转录本和基因组位点。由于O-MAP的酪酰胺自由基化学在标记核酸方面的效率明显低于蛋白质，因此原位生物素化核酸具有一定的挑战性。因此作者在裂解和富集过程保留甲醛的交联，通过pull down生物素化的蛋白来捕获附近的RNA和DNA。总之，本论文发展了一种无需遗传操作邻近标记策略（O-MAP），表征RNA微环境的多组学特征。https://www.nature.com/articles/s41592-024-02457-6原文引用：DOI: 10.1038/s41592-024-02457-6
