大家好，今天给大家分享一篇发表在Nature Chemistry上的文章，题目为“Spatiotemporal protein interactome profiling through condensation-enhanced photocrosslinking”，通讯作者是来自北京大学化生系的陈鹏教授，他一直致力于活细胞中的生物正交化学反应研究及化学生物学技术开发。
生物大分子（如蛋白质、RNA等）通过液液相分离形成的无膜结构称为生物分子凝聚物，能够在时空水平上控制信号转导、应激反应和基因调控等无数细胞过程。因此，分析其中的相互作用蛋白组是十分重要的。临近标记酶（如TurboID, APEX等）是常用的相互作用组研究工具，但其生成的反应性中间体的扩散性使其在凝聚物的分析中很容易得到假阳性结果。位点特异性光交联剂（如DiZPK, o-NBAK, VL1等）能提供有关蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）界面的详细信息，但难以全面描述来自单个选定位点的凝聚物中的多价相互作用。代谢掺入的光交联剂能够将特定氨基酸残基（如Leu, Met）带上光交联标记，但这两种氨基酸在PPI界面上的分布相对较低。
因此，在这篇文章中，作者报道了一种在缩合物中增强的代谢标记的辅助光交联策略——DenseMAP，用于活细胞中凝聚物蛋白质相互作用组的时空分析。作者首先调研了凝聚物中各种氨基酸的丰度，选择经常参与PPI的带正电的赖氨酸，设计了δ-photolysine光赖氨酸探针。作者证明了δ-photolysine是天然赖氨酸的近似物，其定点插入对蛋白质功能和相互作用或细胞生理状态的干扰可以忽略不计，证明了其平均交联半径约为1.2 nm，并通过添加1,6-己二醇处理活细胞破坏液液相分离证明了DenseMAP的标记强度在凝聚物中增强。
大多数凝聚物是在特定条件下瞬时形成的，其蛋白组分可能在多个亚细胞区域存在，因此，作者选择空间限制性生物素连接酶 （BirA）进行亚细胞区域的分析，用于分离不同亚细胞区域的相互作用组，例如应激颗粒（Stress Granules, SG）。作者选择了分布在许多亚细胞区域的分子伴侣Hsp90以及作为SG核心的G3BP1蛋白进行验证，在HEK293T细胞中，将AVI 标记的Hsp90与G3BP1-BirA-EGFP或BirA-EGFP共表达，然后进行NaAsO2处理和生物素标记，并在照射紫外后成功捕获了生物素化的Hsp90及其相互作用蛋白。
由于SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）可以进行相分离到宿主的SG中，分析活细胞中N蛋白的SG特异性相互作用组可能有助于揭示病毒-宿主相互作用的机制，接下来，作者利用DenseMAP对N蛋白在SG中的相互作用组进行了分析。作者在定量分析中共鉴定出85个N蛋白的SG特异性相互作用蛋白，发现SG除了发挥病毒抗性的作用外，可能在病毒侵染后被挟持帮助病毒复制。作者还通过激酶的抑制，探索了磷酸化对SG定位和N蛋白功能相互作用的影响。
最后，作者利用DenseMAP对两个RNA-m6A reader YTHDF1和YTHDF2的SG特异性相互作用组进行比较分析。通过捕获亚区支架蛋白NPM1的直接相互作用组，DenseMAP 揭示了核仁中的颗粒组分（Granule Component, GC）特异性的蛋白质组，从而阐明了SUMOylation对蛋白质控制的关键作用。
总之，作者报道了一种新的凝聚物相互作用组的研究方法，通过代谢掺入光交联赖氨酸探针，并进一步偶联亚生物素连接酶（BirA），实现细胞区域特异性的蛋白质标记和定量蛋白质组学分析。
