Nat. Biotechnol. | 利用SCOPE技术对细胞外囊泡mRNA进行扩增突变分析
学术
2024-10-26 20:02
北京
大家好，本周分享一篇发表在Nature Biotechnology上的文章，文章的题目为“Amplifying mutational profiling of extracellular vesicle mRNA with SCOPE”，本文的通讯作者是来自哈佛医学院的Hakho Lee教授和Cesar M. Castro副教授以及来自成均馆大学的Taejoon Kang副教授，三位教授的研究方向都与疾病的检测有关。细胞外囊泡（EV）因其携带多种分子货物，成为液体活检的重要分析目标。EV中的mRNA能够反映体细胞的突变，对癌症的发生和发展至关重要。此外，EV还可以保护mRNA免受生物体中核酸酶的影响。因此，检测EV中的mRNA具有显著优势。然而，EV中的RNA大多是非编码RNA，肿瘤来源的EV也只占所有EV中的一小部分，因此对EV中mRNA的检测通常需要大样本量和复杂的技术（如微滴数字PCR和下一代测序技术），这导致其难以用于临床分析。CRISPR技术因其序列特异性可以用于分子诊断，CRISPR相关蛋白在识别靶核酸后成为活性内切酶，可以对报告探针（如带有荧光基团和淬灭剂的单链DNA）进行切割来放大信号。然而，由于EV中mRNA的低丰度，这种策略需要对mRNA进行预扩增，这不可避免的带来扩增中固有的复制错误和偏差。本文作者提出了一种自扩增和CRISPR辅助的分析EV的平台（SCOPE），通过其双重放大机制实现了单核苷酸特异性高灵敏度的mRNA检测。SCOPE将CRISPR和靶RNA扩增耦合，SCOPE体系同时包含CRISPR体系（Cas13a/crRNA）和靶RNA扩增（T7聚合酶及NTPs）体系，并引入了设计的RNA-DNA杂交的信号模版。信号模板有三部分，分别是Cas13a/crRNA可切割的荧光RNA片段，荧光淬灭剂以及结合T7聚合酶并转录靶RNA的DNA模版。SCOPE的过程首先是Cas13a/crRNA识别靶mRNA，激活CRISPR活性，然后切割信号模板RNA片段导致荧光信号的释放，切割后的信号模板可被T7RNA聚合酶识别启动转录完成靶RNA的扩增，扩增的靶RNA复制体又与Cas13a/crRNA结合实现信号的放大。作者后续验证了SCOPE确实可以通过耦合CRISPR切割反应和靶RNA扩增反应实现信号的扩增。然后，作者对比了SCOPE和RT-PCR的灵敏度，选择最常突变的癌基因KRAS作为代表验证了其序列特异性。最后作者还将SCOPE用于小鼠肺癌模型的检测，临床直肠癌患者的检测，以及胶质瘤患者的分层，验证了SCOPE技术的临床应用潜力。以小鼠为例，作者首先用不同细胞系验证可以通过EV中mRNA推断细胞基因型，然后在基因工程肺腺癌模型中检测小鼠血浆中EV的mRNA，发现SCOPE结果与免疫组织化学（IHC）和计算机断层扫描（CT）结果相符合。总的来说，本文开发了一种可以实现单核苷酸特异性，高灵敏度的EV中mRNA的检测策略。这种策略在临床中的肿瘤检测中具有一定的应用潜力。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02426-6文章引用：10.1038/s41587-024-02426-6
