大家好，今天为大家推荐一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章“Delineating cysteine-reactive compound modulation of cellular proteostasis processes”，通讯作者是来自UCLA的Backus教授，研究方向为基于活性蛋白组分析开发小分子药物。![]()
近年来，通过基于质谱的活性蛋白组分析（ABPP）已经实现了对于部分蛋白上活性半胱氨酸位点的识别，并评估了它们作为药物靶点的潜力。但对于这些实验中所用标记Cys的化合物是否会引发胞内蛋白组稳态的改变，目前还研究甚少。本文通过isoTOP-ABPP、免疫印迹分析、荧光共聚焦成像等技术，首次鉴定到SARS-CoV-2病毒中nsp14蛋白的共价降解化合物，并阐明了Cys反应性的亲电性化合物JC19导致相关蛋白降解的具体机制。![]()
首先，作者通过isoTOP-ABPP技术，利用针对Cys的亲电化合物鉴定到SARS-CoV-2病毒中的nsp14蛋白，但在实验中发现，对nsp14进行标记后，其蛋白含量相比标记前有明显降低，说明蛋白部分被降解。由此联想到这一过程是否与体内的泛素蛋白酶体降解系统相关，实验结果证明，在加入蛋白酶抑制剂后，降解效果的确受到抑制，同时进一步通过免疫印迹分析，说明了泛素蛋白酶体是能够直接和nsp14互作而引发降解。![]()
然而，令人意外的是，在敲除泛素连接酶E3后发现，蛋白降解并没有被显著抑制，作者推测这一过程并不只与泛素连接酶相关。而进一步的验证实验表明，当突变了蛋白上的泛素化识别位点和Cys活性位点，均发现蛋白不再被大量降解，同时利用荧光蛋白酶活性探针标记，再次证实了蛋白降解和蛋白酶体之间存在联系，亲电探针的处理将会增加蛋白酶体的活性。基于以上结果，作者考虑了一类和蛋白正确折叠过程有关的PDIA伴侣蛋白系列。因为亲电探针JC19在活细胞中具有广谱的标记性，并不只标记一种富含Cys的蛋白，实验证实，这些伴侣蛋白也会被JC19所修饰，当它们丧失功能后出现大量错误折叠的蛋白，引发胞内应激反应致使蛋白被降解。而对胞内蛋白组进行全局分析，发现大量的蛋白都被JC19标记，进一步证明了标记Cys的小分子亲电化合物将对胞内蛋白组稳态造成影响。![]()
这种高浓度亲电化合物诱导蛋白质聚集并进一步降解的现象对核孔蛋白nup153也同样生效。通过荧光共聚焦，发现亲电化合物的添加促进胞内应激内体颗粒的产生，待降解蛋白与聚集体的定位也高度重合，至此阐明了整个蛋白组稳态调节的过程。总而言之，本文详细探究了亲电性化合物对蛋白组稳态调节中的具体机制，对活细胞中ABPP的研究提供了有关探针工作浓度等实验条件的指导。本文作者：SHL
责任编辑：WYQ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01760-9
文章引用：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01760-9
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