一、引言
图1 Stuart L. Schreiber（Maria Nemchuk摄于布罗德研究所）
二、作为化学家的Stuart L. Schreiber：复杂天然产物的全合成
1988年，Schreiber受邀回到哈佛大学担任教授，在这里他开始了自己的化学生物学研究。当时，随着雷帕霉素于1972年被提取鉴定，并后续被发现具有免疫抑制的重要作用，学术界掀起了免疫抑制药物研发和机理阐明的热潮。两种具有类似效果的免疫抑制剂，环孢霉素A（cyclosporin A, CsA）和FK506陆续被推出，与雷帕霉素一起，成功应用于抑制临床器官移植手术过程中的排异反应，其中CsA和FK506都是通过抑制T细胞活化早期相关基因的转录来达到免疫抑制作用的。来到哈佛后，Schreiber教授首先投入了FK506、CsA和雷帕霉素作用机制的研究中。1989年，为了研究FK506与CsA相似的免疫抑制特性是否来源于相同的免疫抑制机制，Schreiber合成了FK506的氨基衍生物，并制备了FK506的亲和基质，将牛胸腺和人脾脏的细胞质提取物与该亲和基质孵育后，再用纯FK506进行洗脱，通过这个方法，得到了FK506结合蛋白（FK506 binding protein, FKBP），后续被称为FKBP12，是FKBP蛋白家族中最小的一个，免疫印迹分析以及N端测序表明，该蛋白与CsA结合蛋白并不相同，而是一种从未被报道过的在人与牛之间保守的蛋白，但这种FKBP和CsA结合蛋白一样有肽基脯氨酰基顺反异构酶的活性（图3）。Schreiber还发现，雷帕霉素可以和FK506竞争FKBP12，而CsA则完全不能。FK506是FKBP12顺反异构酶活性的抑制剂，因此这一研究佐证了当时学术界基于CsA结合蛋白的脯氨酸顺反异构酶活性提出的观点，即对脯氨酸位点的识别或者异构化很可能在T细胞活化时间中起着很重要的作用，并揭示了结构不同的顺反异构酶家族的存在[6]。
为了更好地进行FK506免疫抑制机理的研究，Schreiber实验室紧接着完成了FK506的全合成，因为FK506抑制FKBP的活性位点的机理可能有两种，一种是FK506与FKBP的活性位点形成了稳定的四面体中间体，另一种为FK506的酮羰基作为底物替代物占据了FKBP扭曲底物酰胺键的位置，导致酶活性的抑制；因此Schreiber在FK506的其C8、C9位进行了13C取代，设计了一种FK506探针，用于FK506-FKBP复合物的核磁共振研究 [7]，并在后续的研究中证实了扭曲酰胺键替代机制为FK506抑制酶活的真实机制[8]。
在阐明了FKBP-FK506的相互作用机制之后，Schreiber开始将目光投向信号通路更下游的机制研究。FK506和CsA直接作用的蛋白并不相同，然而却有类似的免疫抑制效果，这表明FKBP-FK506复合物以及cyclophilin -CsA复合物很可能作用于一个相同的靶标蛋白。Schreiber实验室1991年的工作解答了这一问题[9]，他们首先构建并在大肠杆菌中过表达和纯化了带GST标签的FKBP12蛋白或cyclophilin蛋白（分别称为GFK和GcyP），然后通过GST的下拉实验，发现无论是GFK-FK506复合物还是GcyP-CsA复合物，都可以从外源添加了Ca2+或Mg2+的组织提取液中下拉得到位于61, 57, 17, 15 kDa处的相同条带，而GFK-rapamycin复合物则无法下拉到相同的靶蛋白（图4 a）。竞争实验表明，两种复合物（FKBP-FK506和cyclophilin-CsA）以及EGTA都可以与GFK-FK506竞争靶蛋白，但单独的FK506, CsA, FKBP12或cyclophilin都不行，进一步佐证了两种复合物结合同一种下游靶标蛋白，且结合过程依赖于金属离子（特别是Ca2+），且条带电泳表现出钙依赖性的电泳迁移特性。基于这一事实，Schreiber推测，17 kDa处的条带很可能是一种钙调素，而其余三条条带则是钙调蛋白复合物的不同亚基（61 kDa和15 kDa分别为钙调蛋白A、B，57 kDa为钙调蛋白A水解产生），最终通过western blot以及45Ca2+ ligand-blotting实验证实了这一推测（图4 b）。至此，Schreiber阐明了FKBP-FK506和cyclophilin-CsA具有相同的靶蛋白，钙调磷酸酶（Ca2+ and calmodulin-dependent phosphatase calcineurin），并通过形成三元复合物的方式抑制其磷酸酶的活性（图4 c）。这项工作与斯坦福大学Gerald R. Crabtree教授关于NFAT蛋白以及其他关于T细胞活化的研究一起，完成了钙-钙调磷酸酶-NFAT信号通路的阐明，也彻底揭示了FK506和CsA的免疫抑制机制[10, 11]。
Schreiber关于信号通路的另一项重要工作是发现了哺乳动物细胞中的雷帕霉素靶点，Schreiber将其称为FRAP蛋白[12]（FKBP-rapamycin-associated protein，即David M. Sabatini同时期发现并命名的mTOR蛋白[13]，因为本文以Schreiber为主线，下文均称之为FRAP蛋白）。上文所阐述的工作已经证明了FK506和CsA会与不同的蛋白结合，但下游的信号通路相同；而雷帕霉素和FK506都会与FKBP12结合，下游的信号通路却有所不同[14, 15]。当时，FKBP12-雷帕霉素复合物已经被发现可以干扰包括T细胞在内的多种细胞细胞周期G1期相关的有丝分裂信号通路，其在酵母细胞体系中的靶点也已经被阐明，即大名鼎鼎的TOR（target of rapamycin）蛋白[16]，而Schreiber教授则在哺乳动物体系中完善了这一工作。Schreiber利用GFK蛋白和雷帕霉素的复合物（GFK-Rap）以及GFK蛋白与两种细胞G1期效果弱于雷帕霉素的衍生物的复合物（GFK-Ketorap和GFK-Isorap）从哺乳动物细胞提取液中下拉复合物的结合蛋白，并在220 kDa处得到了唯一雷帕霉素特异的结合蛋白条带，将其命名为FRAP（图5 a）。Schreiber发现，抑制效果更弱的两种衍生物需要以更高浓度孵育才能下拉得到FRAP，这说明FRAP很可能是这几种复合物发挥抑制效果的靶蛋白。随后，Schreiber从牛脑中纯化得到了bFRAP蛋白，用Trypsin或Lys-C进行消化，然后对水解片段测序，得到了bFRAP蛋白的部分序列；Schreiber在此基础上设计引物，在人类细胞中进行PCR，获得了最长为7.6 kb的连续序列，再用32P化的该cDNA作为探针，通过Northern blot分析在多种人类组织和细胞中提取的寡聚dT 纯化的RNA，最终得到了全长为8.5 kb的开放阅读框（open reading frame, ORF），完成了人源FRAP蛋白的完整测序。Schreiber发现，FRAP蛋白与之前在酵母中发现的TOR蛋白在基因上高度相关，与TOR1有44%相同，与TOR2有46%相同，并与磷脂酰肌醇激酶的序列具有同源性，因此很可能有激酶活性。这项工作表明，FKBP12与不同的天然产物形成复合物（FK506或雷帕霉素）后，可以与两种不同的蛋白（calcineurin和FRAP）结合，参与调控细胞周期发生和发展的两种截然不同的信号通路。
因为FKBP12-雷帕霉素复合物可以与FRAP蛋白结合[17]，而雷帕霉素的添加又被证明可以导致p70 S6激酶（p70_S6k）和周期蛋白依赖的激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）的激活，Schreiber认为，FRAP蛋白很有可能是FKBP12-雷帕霉素复合物导致下游激酶激活的媒介。1995年，通过构建FRAP的突变蛋白，Schreiber在活细胞内证明了FRAP蛋白是雷帕霉素敏感的p70_S6k活性调控器[18]。Schreiber发现，FRAP在体外可以自磷酸化，自磷酸化的过程会被FKBP-雷帕霉素复合体抑制，而FRAP蛋白D2338和D2357位的突变会使其失去自磷酸化的能力。由于FRAP的S2035位的突变被报道可以阻止其与FKBP-雷帕霉素复合体的结合，表明FRAP的突变体蛋白的活性很可能具有雷帕霉素的“抗性”，于是Schreiber猜测，如果在雷帕霉素存在的情况下，细胞内源的FRAP作用会被抑制，那么，只有表达了突变体蛋白的转染细胞可以对p70_S6k的活性进行调控（图6a），调节p70_S6k活性的FRAP结构域也可以通过对突变体蛋白的结构进行调整，并测定其抗性来进行鉴定。于是，Schreiber构建了FRAP的突变体与带HA标签的p70_S6k共表达，并测定活细胞内p70S6k的活性，发现，实验结论与猜想一致，FRAP蛋白对p70S6k的激活依赖于自磷酸化，并且S2035的突变会使其获得对雷帕霉素的抗性（图6b）。最后，Schreiber通过截短实验证明，N端结构域对FRAP蛋白调控p70_S6k以及突变体产生雷帕霉素耐药性是必须的，而FRAP蛋白的激酶结构域则位于C端。这项工作不仅证实了FRAP蛋白对下游p70_S6k激酶的调控作用，还阐明了一种研究活细胞内蛋白质功能的方法，即使FRAP蛋白会在活细胞内普遍表达，也可以通过表达有耐药性的突变体蛋白的方式，在活细胞内表征其功能，这在缺少基因编辑技术的当时，是一种非常高明的研究策略。
1995年，Schreiber教授因其在在化学生物学、分子生物学领域的一系列杰出贡献当选美国院士。在此后十年的时间里，Schreiber教授与当时许多杰出的科学家一起，逐步完善了以TOR蛋白为核心的营养反应信号网络，Schreiber教授充分发挥其在化学方面的优势，做了大量的研究工作，以天然产物为桥梁，打通了化学与生物学之间的通道。至今，关于雷帕霉素新的药理作用的研究仍在继续……
除了以TOR蛋白为核心的信号通路研究之外，Schreiber还有很多杰出工作阐明了天然产物对于生物过程的调控和影响，以及用于生命科学研究的潜力。例如，1995年，Schreiber团队发现lactacystin结合并抑制蛋白酶体的水解活性，共价修饰哺乳动物蛋白酶体亚基X（也称为MB1）的高度保守的氨基末端苏氨酸[19]。Schreiber另一项非常重要的工作是利用trapoxin分离出了具有组蛋白去乙酰化酶活性的核蛋白（HDACs，David Allis同时发现）[20]，与David Allis和Michael Grunstein一起开辟了组蛋白修饰研究的新领域。
Schreiber教授做了大量的工作，阐明了天然产物发挥其信号转导调控作用的机理，并揭示了其下游的信号转导网络。许多蛋白受体的胞外和跨膜区域是通过依赖配体的二聚化或寡聚化使受体的胞质结构域靠近而起作用的,而受体的胞质结构域则向细胞内部进一步传递特定的信号，导致整个信号转导通路的激活。那么，能不能反过来，通过合理地设计化学探针，实现基因调控或功能分析呢？1993年，Schreiber和Gerald R. Crabtree在Science上发表文章，提出可以利用小分子探针，在活细胞内诱导蛋白的二聚化。他们从FK506出发，利用FK506可以结合FKBP12的特点，设计了一种可跨越细胞膜的，诱导FKBP12在细胞内接近并进行二聚化的探针，FK1012。使用FK1012可以触发信号传递并激活特定的靶基因，而再添加单体形式的FK506与二聚体竞争则可以阻断这条信号通路，实现目标基因的精确调控（图7）。除此之外，这篇文章也代表了一个重要概念的提出，即 “化学诱导邻近”（chemical induced proximity, CIP），利用可跨膜的双功能小分子诱导生物大分子的接近，使其强制二聚从而进行细胞信号转导过程和基因表达的调控[21]。化学临近诱导剂，也就是“分子胶”（molecular glue）的提出，从概念上催化了蛋白靶向降解技术，也就是PROTAC的产生。
基于药物和治疗靶点开发与筛选的需求，Schreiber提出了区别于传统“目标导向合成”的“多样性导向合成”（diversity-oriented synthesis, DOS）。受到传统生物遗传学研究中“诱导随机突变，然后对表型进行筛选”的研究思路的启发，Schreiber认为，合成一系列具有结构复杂性和多样性的小分子文库可以同时筛选适合作为治疗干预靶点的蛋白质（therapeutic target validation）以及可以调节这些治疗靶点功能的小分子（chemical target validation）。他提出了一个蛋白靶标和药物发现的流程，首先使用生物方法选择适合进行治疗性干预的蛋白质靶点，然后通过化学手段确定蛋白质靶点是否可以被小分子调节，以及筛选可以结合该蛋白靶标的小分子[22]。例如，1999年，Shreiber和Tim Mitchison合作，利用该策略，发现了可以影响细胞有丝分裂过程的新型靶蛋白和小分子。在此之前，所有已知的抑制有丝分裂过程的小分子都靶向微管蛋白，因此，Schreiber从小分子出发，首先利用细胞印迹实验对核蛋白磷酸化的状况进行表征，观察细胞受小分子处理后的有丝分裂状况，从含有16320个小分子的文库中高通量筛选出了139个可以对有丝分裂造成影响的小分子。为了发现除微管蛋白以外其他可以影响有丝分裂的蛋白靶标，Schreiber又从这139个化合物中挑选了86个体外对微管蛋白聚合无影响的小分子，进一步通过荧光成像实验观察他们对有丝分裂表型的影响，最终从中得到了一个新型的影响细胞有丝分裂的小分子，monastrol。随后，Schreiber证明了有丝分裂运动蛋白Eg5是该小分子的靶标，可以作为新型抗癌药物靶标或研究有丝分裂过程的媒介（图8）。在这里，Schreiber提出，区别于对单一的蛋白质活性进行筛选，筛选影响特定途径或过程的小分子的方法，被称为化学遗传学，因为它在概念上与生物学研究中经典的正向遗传筛选过程类似[23]。在此之后，Schreiber对DOS方法进行开发和优化，并利用DOS和化学遗传学，开发了多种新型蛋白靶标，以及新型的治疗药物。2003年，Schreiber推出了ChemBank公共数据库，以推动化学遗传学的发展。
2010年以后，Schreiber的研究更注重于利用小分子筛选和化学遗传学策略对疾病发生发展的机制进行研究，开发新型的治疗靶点和药物。例如，2016年，Schreiber利用DOS策略，从Broad研究所构建的含有10万种化合物的化合物库中通过表型筛选得到了对耐药性疟原虫株具有抑制效果的双环氮杂环丁烷系列小分子药物，并通过抗性克隆的培养和测序确定了苯丙氨酰tRNA合成酶是该药物的靶点，对药物的结构进行优化后，得到BD7929具有较好的疗效，最后在小鼠口服的模型中进行了验证（图8）[24]。
2017年，Schreiber对癌细胞产生耐药性的机制进行了研究，耐药的肿瘤细胞会表现出一种高间充质状态（也就是肿瘤细胞的上皮细胞-间充质细胞转化过程，与肿瘤侵袭性和耐药性高度相关），通过对癌细胞间充质状态和药物治疗效果进行评分，Schreiber从公开的数据中筛选出了7种“间充质状态靶向化合物”。通过对化合物细胞毒性和基因敲低的关联进行研究，最终建立了包含13个分子节点的途径（图9），Schreiber表示，这些节点是高间充质状态细胞产生耐药性的基础，依赖于脂质过氧化途径，主要涉及长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成、储存和利用，这些脂肪酸容易通过脂氧合酶的作用变成反应性脂质过氧化物。脂质过氧化物酶，GPX4可以消除这些反应性过氧化物使他们变成无毒性的醇，从而保护细胞免受铁死亡的影响。因此抑制PUFA代谢的上游调节因子（ACSL4，LPCAT3）或抑制脂氧合酶可以阻止抑制GPX4引起的细胞死亡[25]。
截止目前，Schreiber一共发表了635篇论文，引用超过十万次，其核心是用化学小分子揭示和调控生命过程，他的研究为化学生物学领域带来了巨大的贡献，更是在概念上为后来者提供了研究思路和启发，本文仅仅只是挑选了其中的一小部分进行概述。目前，Schreiber已从布罗德研究所和哈佛大学荣誉退休，但仍然在科研领域中进行指导工作。当2020年新冠病毒在全球席卷时，Schreiber与许多科学家联合起来，试图以最快速高效的方法开发出可以组织这场传染病浪潮的药物或疫苗。受此启发，今年一月，Schreiber作为联合创始人建立了盈利性研究机构Arena BioWorks，希望加速疗法开发的流程，提高生物医学研究的效率[26]。
什么是化学生物学？Stuart L. Schreiber用他四十余年的研究生涯回答了这个问题。著名的中心法则认为，遗传信息从DNA传递到RNA，再从RNA传递到蛋白质，由蛋白质执行各项生理功能。然而，生命不可能只靠大分子存在，化学家出身的Schreiber敏锐地发现了小分子这个中心法则中缺失的“孤儿”。小分子涉及生命法则中从DNA到蛋白质的每一个环节，也是我们研究和干涉生命过程的重要媒介，Schreiber认为，化学生物学弥补了中心法则中缺失的小分子部分，将这个故事描述得更加完整[27]（图10）。
撰写这篇文章不仅是为了表达对Schreiber杰出研究工作的敬意，更是希望通过他的故事，让大家了解他作为化学生物学这一交叉学科的奠基者之一所做出的重要贡献。他的研究不仅拓展了我们对化学和生物学交汇处的认识，也为未来的科学探索打开了新的大门。期望通过这些内容，能激发更多人对化学生物学这一领域的兴趣，去发现其中蕴藏的无限可能。
