核酸适配体是能折叠成特定三维结构与靶标结合的单链寡聚核苷酸分子，是重要的分子识别元件。其与靶标的结合亲和力（通常以解离常数Kd值衡量，Kd值越低，亲和力越高），是适配体的关键特性。高亲和力适配体在生物分析、医学诊断及治疗等领域展现出广阔的应用前景。然而，多数适配体为单体型，其结合能力有限。尽管多聚适配体的整合策略能够提升与靶标的结合力，但该过程需先筛选适配体单体，再进行表征优化，最终组合形成二聚或多聚适配体，构建方法繁琐且耗时。因此，一种能够通过筛选直接获得高亲和力二聚或多聚体适配体的高效方法备受期待。
近期，加拿大麦克马斯特大学李应福课题组通过一种新型的双随机结构域（Dual Random Domains，DRD）文库设计策略（图1A），成功通过筛选直接获得了多种针对新冠病毒（SARS-CoV-2）的高亲和力二聚适配体（图1C），解离常数Kd值低至～150 pM（图1D）。相较于传统的先筛选后组合制备二聚或多聚适配体的方法，该方法具有显著的快速高效性，为未来快速获取高亲和力适配体提供了新方法，在众多相关领域具备潜在应用价值。
图1 双随机结构域文库策略筛选新冠病毒高亲和力二聚适配体：（A）双随机结构域文库设计（B）筛选示意图（C）代表性高亲和二聚适配体序列（D）解离常数Kd值测定结果
本研究设计的DRD文库包含两个随机结构区域（各含有25个随机核苷酸），由聚胸腺嘧啶（poly-T20）连接分隔，两端引物形成稳定发夹结构（图1A）。研究以新冠病毒奥密克戎BA.5亚变体的刺突蛋白（S蛋白）为靶标，S蛋白具有同源三聚体结构，经16轮筛选（图1B），发现文库亲和力显著提升。通过高通量测序，获得50条优势序列，分属14个类别，表明该文库能够发现针对多亚基蛋白靶标的多种适配体。进一步对排名前5类适配体的亲和力进行评估（图1C），发现它们的Kd值均低于1 nM（图1D），其中DRDA8亲和力最高（Kd = 150 pM），远优于对照的适配体单体MSA52（Kd = 2.5 nM）和组合制备的二聚体适配体DSA52（Kd = 0.52 nM）。此外，DRDA8能与表达BA.5 S蛋白的假型病毒结合（Kd =4.3 fM），但不与对照蛋白或病毒结合，表明其具有较高的特异性。
图2 高亲和力二聚适配体DRDA8的截短和Kd测定
二级结构预测结果显示，筛选出的适配体均呈三向连接结构，多数适配体具有相似的左或右臂结构。为验证其二聚体特性，研究者对具有代表性的DRDA8进行截断和序列打乱实验，结果表明两个结合臂对靶标识别至关重要且存在协同作用（图2）。竞争实验表明，它们可能作为同型二聚体，识别S蛋白的同一表位。基于S蛋白的同源三聚体结构以及新冠病毒表面的多结合位点，以DRDA8为代表的高亲和力适配体，有助于实现更准确、快速的分析检测与诊断。
综上所述，DRD文库策略能够在短时间内筛选出高亲和力二聚体适配体，DRDA8对S蛋白的亲和力优于单体和组合的二聚体适配体，且特异性高。未来可进一步开展异源二聚体构型的研究，以提高对S蛋白不同表位的结合能力。该策略有望在快速获取用于诊断和治疗的分子识别元件方面发挥重要作用。
论文信息：
Dimeric DNA Aptamers for the Spike Protein of SARS-CoV-2 Derived from a Structured Library with Dual Random Domains
Ryan Amini, Jian Ma, Zijie Zhang, Qing Wang, Jimmy Gu, Leyla Soleymani, Yingfu Li*
Small Methods
DOI: 10.1002/smtd.202401600
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