1.研究背景
DNA结构的稳定性是其生物医用的关键因素之一。为了提高DNA在体外环境中的抗降解能力，研究人员开发了许多方法，包括在固相合成中添加化学修饰以及辅助因子。然而，这些方法适用于固相合成DNA体系，其序列长度一般低于200个碱基，对于长单链DNA并不适用，此外，辅助因子会以链间/链内交联两种形式在DNA链上随机产生交联点，从而影响供体的功能。因此，如何对DNA供体进行精准地共价交联，增强DNA供体的抗降解能力和稳定性，是具有挑战性的课题。
2.文章概述
近日，中国科学技术大学肖石燕教授、梁好均教授课题组提出了一种基于3-氰乙烯基咔唑核苷（CNVK）与胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸碱基（T）的精准交联来提高DNA抗降解能力的策略。该方法可以在不增大细胞毒性的前提下，提高lssDNA供体的基因敲入效率（约3到8倍）。
3.图文导读
在该策略中，CNVK被修饰到ssODN的特定位置上，并通过光激活的方式，实现了ssODN与DNA供体中特定位置T碱基的共价交联（图1a）。与没有交联结构的ssDNA相比，含有共价交联结构的ssDNA更容易组装形成TDN结构，其产率高达94%（图1b），且展现出更高的抗血清降解性能。该策略也可在不同环境下保护功能性核酸免受核酸外切酶的消化和降解（图1c）。
图1（a）光交联流程图。（b）TDN以及TDN-uv的结构示意图。交联尾可以提高TDN-uv的产率。（c）交联尾可以提高DNA的抗核酸外切酶降解性能。
对于TDN结构来说，在ssODN的末端添加惰性尾可使TDN的产率从67%提高至94%，且R值从2提高至16以上（如图2）。此外，具有交联的双链惰性尾的TDN具有更高的抗血清降解性能（如图3）。
图2（a）四种TDNs的制备示意图。（b）不同退火程序制备的TNDs的R值（ITDN/Iby-products）。（c）四种TDNs对应的PAGE凝胶电泳图。（d）PAGE胶中不同产物物质组成的定量分析。（e）不同结构的TDNs、三聚体以及二聚体的结构示意图。（f）不同结构的TDNs、三聚体以及二聚体的Tm和ΔTm。
图3（a）ssDNA和TDN的抗血清降解示意图。（b）PAGE凝胶电泳图，该图可量化ssDNA和TDN的降解量。（c）在10%血清中，不同反应时间后，ssDNA和TDN的残留百分比，该百分比由条带的相对密度确定。（d）ssDNA被exo I（20 U）外切酶降解的动力学曲线。（e）ssDNA被DNase I（5 U）降解的动力学曲线。
Exo III和ssDNA的浓度以及3’悬突的长度均对ssDNA的抗exo III降解能力具有一定的影响（如图4）。通过优化上述条件，并将该成果应用于基因编辑体系，可以提高lssDNA供体在细胞内的基因敲入效率（如图5）。
图4（a）Exo III消化ssDNA和dsDNA的示意图。（b）Exo III和ssDNA浓度对ssDNA抗降解能力的影响。（c）ssDNA中3’悬突长度对exo III消化能力的影响。（d）具有3’凹陷结构的3’-X非辐射双链DNA（X为3’悬突的长度）被exo III消化的动力学曲线。（e）双链末端的3’悬突和3’凹陷结构对辐射双链DNA（CNVK-r3’-6）抗exo III消化能力的影响。
图5（a）lssDNA供体的基因敲入示意图。（b）具有共价交联点的lssDNA供体的制备示意图。（c-d）lssDNA供体制备过程的琼脂糖凝胶电泳图。（e）Exo III消化lssDNA供体所得产物的琼脂糖电泳图。（f）三种lssDNA供体在HEK293T细胞中 Lamin A/C位点的基因敲入效率和细胞存活率。三种lssDNA供体分别在HEK293T、K562和HepG2细胞中Lamin A/C位点（g）和GAPDH位点（h）的基因敲入效率。
4.结论
基于CNVK与T碱基之间的环加成反应，肖石燕教授、梁好均教授课题组提出了一种稳定DNA结构的光交联策略，提高了功能核酸在不同环境下的抗降解能力，并在不提高细胞毒性的前提下，显著提高了lssDNA供体在不同细胞中的基因敲入效率。该策略允许将交联结构精确地引入到DNA序列的不同位置，这使lssDNA供体在设计上具有更多的可操作性。
该项目研究获得国家自然科学基金（22422306，22073090，21991132，52021002）和国家重点研发计划（2024YFA1509200，2020YFA0710700）资助，谨此感谢。
论文信息：
Photo-Cross-linked DNA Structures Greatly Improves Their Serum Nuclease Resistances and Gene Knock-In Efficiencies
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