生命的奥秘藏匿于亿万分子间的协作之中。基因组DNA紧密包装成复杂的3D结构，调控转录活动；RNA从DNA中转录出来，进一步控制蛋白质的翻译；而蛋白质则维系着生命的正常运行。为了揭示这些生物分子活动，荧光显微镜成为科学家不可或缺的工具。荧光显微镜通过激发荧光染料记录生物分子的分布和动态。然而，传统的荧光成像技术面临着分辨率受限、低丰度目标信号弱以及多分子分析复杂等挑战。那么，如何突破这些限制？答案之一就是利用DNA的编程特性，从分子层面重新定义荧光成像。
1.DNA是自然界的编程语言
DNA不仅是遗传信息的载体，更是一种可编程的分子工具。基于其双螺旋结构和碱基配对规则，DNA的稳定性、反应动力学及计量比都可以通过设计序列精确控制。这种独特的可控性，使得DNA成为荧光显微技术创新的核心。
DNA具有可编程的动态反应过程，可以用于设计荧光分子探针，自然界中也有各种各样的酶能和DNA反应开发新的酶促反应。这些反应增强了荧光成像的灵活性和灵敏度，从而可以极大的拓宽生物荧光成像的通道、精度以及信号。
除了动态反应，DNA还能通过多链自组装构建复杂的纳米结构，例如DNA折纸技术，利用一条长链DNA与上百条短链DNA折叠形成任意形状的纳米结构，可以为荧光探针的几何排列提供了精准模板。由于DNA折纸的高度精确寻址特性，可以利用DNA折纸中设计的间隔标记点，为验证超分辨显微镜的分辨能力提供了高精度参考。
图1. DNA反应的可变性
2.光学极限与超分辨成像的挑战
光作为波，受其波长限制，传统荧光显微镜的空间分辨率无法突破约200-300纳米的阿贝极限。这种限制使得在衍射极限内的生物目标难以区分。未来突破光学衍射极限，DNA-PAINT是一种利用DNA短链的瞬时结合特性实现超分辨成像的方法。目标分子被标记上短DNA链，作为对接位点；随后，与其互补的荧光标记DNA成像探针加入样品，通过弱杂交作用反复结合和解离，产生闪烁事件。通过累计的单分子点扩散函数信息，研究者能够重构图像，实现高达几个纳米级别甚至更高的分辨率。未来，这些技术有望为复杂生物系统研究提供更强大的工具，推动从分子水平探索生命奥秘的进程。
图2. DNA-PAINT超分辨荧光显微镜
3.多通道生物成像的挑战与机遇
生物系统高度复杂，分子种类、数量及空间分布各异。然而，传统荧光显微镜受限于荧光染料的光谱重叠，最多能分辨3-5种分子目标。为解决这一问题，研究者开发了基于DNA可编程交互的信号循环交换技术，显著提升了多重成像能力。
DNA信号交换技术通过多轮染料切换实现超多重成像。在每轮成像中，目标分子与特定的DNA成像探针配对，通过冲洗引入正交DNA链清除探针后，重新引入新一轮探针进行成像。这种方法可对细胞和组织中的10至100种蛋白质分子目标进行成像。对于RNA和DNA成像，通过多轮组合编码进一步提升多重能力，达到基因组和转录组规模。目标分子的荧光信号会以编码形式在不同轮次出现，最终生成信号条形码。诸如 MERFISH 和 SeqFISH 技术已成功实现转路组学级别目标的成像，广泛用于癌症、衰老等生物问题的研究。
基于DNA信号交换的多重成像技术正在从分子到基因组的尺度全面革新生物学研究。这一技术不仅解决了传统成像的局限性，更为理解生命复杂性提供了全新视角。
图3. 基于DNA的多通道荧光成像
4.DNA增强信号放大技术：提升生物成像灵敏度
生物成像中的信号通常受限于信噪比，尤其是对于低丰度蛋白和短链RNA等生物靶标分子。传统的信号增强方法，如提高激光强度或延长曝光时间，存在时间限制，并可能延长成像过程。为了解决这一问题，DNA信号放大技术提供了新的解决方案，从而实现信号的显著增强，例如杂交链反应（HCR）和滚环扩增（RCA）增强目标分子的荧光信号，特别适用于厚组织样本，这些方法已成功应用于RNA和蛋白质的高灵敏度成像，尤其在大脑组织样本中解析了数百种RNA。 DNA增强信号放大技术为生物成像提供了更高的信号与分辨率，推动了多重成像和基因组、转录组的高通量研究。
图4. 基于DNA的荧光信号放大
DNA增强荧光成像技术已广泛应用于研究多种生物学问题，从单分子活动到细胞和组织样本中的系统性生物分子谱系。为了更好地理解细胞如何工作以及疾病如何由细胞功能失调演变，许多隐藏的生物分子信息需要被揭示，如远程相互作用、低丰度目标和化学修饰。DNA的高度可编程性使其在开发新型成像方法方面具有巨大潜力，从而解锁这些隐藏信息。
论文信息：
Programmable DNA Reactions for Advanced Fluorescence Microscopy in Bioimaging
Fan Hong*
Small Methods
DOI: 10.1002/smtd.202401279
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