常规基于固相载体法的核酸提取试剂盒通常以高浓度胍盐和蛋白酶k进行样本的裂解,然后以乙醇、异丙醇等一元醇作为结合液,并且后续的洗涤液中基本都含有乙醇成分。
在特定条件下,固相载体磁珠表面包被有如硅基、氨基或羧基等,或固相硅胶膜载体,依靠静电、疏水和氢键作用,可实现核酸与磁珠的特异性结合,通过若干次洗涤实现非特异性杂质、盐类等的去除,然后将核酸从固相载体上洗脱下来实现提纯。
磁珠、硅胶膜固相载体上一般会残留一定量的蛋白、大分子和盐类,清洗步骤有助于去除这些杂质。
杂质通常有两种清洗方式,因样本而异。通常分为两步洗涤,第一步会用中等浓度的离液盐和醇去除蛋白质,然后用乙醇清洗以除去盐类。
庄主推荐:
常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。
庄主推荐:“ 细胞裂解 ”用什么?
a.去污剂的作用
破坏膜结构(细胞膜+核膜);使蛋白质变性+溶解;破坏DNA与蛋白质间静电作用从而使二者分离。
庄主推荐:生命保护伞“ 细胞膜和细胞壁 ”
b.盐的作用
提供合适的裂解环境(pH),如Tris;抑制核酸酶对核酸的降解,如EDTA;维持核酸结构稳定,如NaCl。
c.离液盐
离液盐同时对于核酸与硅基质的结合至关重要,并且为增强两者的吸附强度,通常在结合阶段还需加入乙醇或异丙醇。
由于SDS和异硫氰酸胍难于互溶,而在结合阶段直接加入乙醇通过又会干扰SDS、异硫氰酸胍和蛋白的裂解效果,这些流程通常都是分步进行,比如先通过sds和蛋白酶k的初步裂解,然后加入含胍盐的溶液进一步裂解,再加入含醇的结合液进行结合依次完成。
d.蛋白酶k
参考文献:
[1]核酸知识系列(三)|RNA|DNA|盐酸胍|核酸|乙醇|浓度|-健康界
[2]一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒的制作方法
文章来源于分子庄园,作者木子庄主