2023年9月25日，中国农业大学生物学院郭岩教授和周文锟教授团队合作在Developmental Cell杂志上发表了题为“On salt stress, PLETHORA signaling maintains root meristems”（ https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.06.012）的研究论文。该研究发现了植物中存在AP2结构域转录因子PLETHORA1/2（PLT1/2）参与盐胁迫调控过程。在盐胁迫下SOS2磷酸化PLT1/2以使其稳定，保持分生组织的活性并促进盐胁迫缓解后根系的生长恢复。
研究背景
近年来伴随着人口的增长、农田退化和淡水资源短缺等环境问题日益严重，土壤盐渍化越来越严重。植物面临如何维持生长与抗逆之间平衡的重大问题。盐胁迫是制约植物生长的最主要的非生物胁迫之一。根系作为植物用以固着生长的地下器官，不仅帮助植物吸收水分和各种营养元素，更是植物最先感知土壤盐浓度的器官。盐胁迫抑制根系生长，导致农业植物生物量减少，它影响种子发芽、作物生长和生产力。因此，研究植物如何响应并适应盐胁迫的机制变得至关重要。
关于植物如何维持根系生长以抵抗盐胁迫，我们知之甚少。据报道，拟南芥中的盐信号通过磷酸化激活SOS2以稳定PLT 1/2蛋白，并且磷酸化的PLT 1/2在盐胁迫和胁迫缓解后根生长的恢复下保持分生组织活性，AP2结构域转录因子PLETHORA1/2 (PLT1/2)在拟南芥根分生组织维持中起主要调控作用。在本研究中，盐过度敏感(SOS)通路组分SOS2在转录后水平调控PLT1/2。盐激活的SOS2通过其保守的c端基序相互作用并磷酸化PLT1/2以稳定PLT1/2，这对盐胁迫下根尖分生组织的维持至关重要。拟磷型PLT1/2恢复了sos2-2和pit1-4 - pit2突变体在盐处理下分生组织和主根长度的减少。此外，SOS2介导的PLT1/2磷酸化促进了盐胁迫缓解后根系的生长恢复。SOS2-PLT1/2核心蛋白模块，它是保护主根生长和分生组织维持免受盐胁迫所必需的。
技术路线
研究结果
1、在盐胁迫下根系分生组织维持需要PLT1/2
通过将野生型(WT) Col-0拟南芥种子在1/2MS培养基上进行萌发，分别置于±50 mM NaCl下处理，在相同的时间进行实验，并证实在盐胁迫下，与对照相比，初生根生长和根分生组织长度都减少了。实验探讨了plt1/2和SHR/SCR在盐胁迫中的作用，并观察了plt1/2、SHR和SCR突变体在盐胁迫下的初生根生长和根分生组织长度。
50 mM NaCl处理后，与Col-0相比，shr-2和scr-3突变体的初生根长度、分生组织长度和分生组织细胞数量均有相似的减少，分生细胞数量减少。与WT相比，NaCl处理后的plt1-4单突变体、plt2-2单突变体、plt1-4 - plt2-2双突变体对初生根生长、分生组织长度和分生组织细胞数量的抑制作用增强，分生细胞数量减少。
作者观察到高浓度NaCl (100 mM NaCl)对plt1、plt2单突变体和plt1-4 - plt2-2双突变体的主根长度的抑制作用增强，但与50 mM NaCl处理相比，shr-2和scr-3突变体的主根长度并没有进一步减少，表明plt1-4、plt2-2和plt1-4 - plt2-2等对NaCl敏感，但shr-2和scr-3对NaCl的敏感性较低，主根长度没有进一步减少。不同基因型的根分生区细胞平均长度均不受50 mM NaCl处理的影响，说明50 mM NaCl处理不会减少分化的根细胞伸长。故NaCl处理后的根分生组织维持需要PLT1/2。
图1. PLT1/2调控的分生组织维持对盐胁迫下根系生长具有重要意义
2、SOS2维持根系，在盐胁迫下调节PLT1/2蛋白质水平
SOS2在盐胁迫下离子稳态中起到关键的作用。NaCl敏感突变体sos2-2在NaCl处理24 h后，初生根生长和分生组织大小的减少幅度更显著。G2/M期细胞周期标志物pCYCB1，在NaCl处理后Pcycb1：：GFP,sos2-2突变体的绿色荧光蛋白(GFP)也降低。
为了研究SOS2是否通过PLT途径调控根分生组织维持，作者将启动子融合细胞系PLT1pro::青色荧光蛋白(CFP)、PLT2pro::CFP以及蛋白融合细胞系PLT1pro:: plt1 -黄色荧光蛋白(YFP)和PLT2pro::PLT2-YFP引入到SOS2 -2突变体背景中。在NaCl处理和无NaCl处理的时间过程中，sos2-2和WT的根分生组织PLT1pro::CFP和PLT2pro::CFP信号是相似的。
与之前的实验一致，在实时定量PCR实验也显示，随着时间的推移，在NaCl处理后，WT和sos2-2突变体背景中的PLT1/2转录本相似。在没有NaCl处理的情况下，sos2-2和WT背景下PLT蛋白融合体的YFP信号是相似的。与1/2 MS相比，NaCl处理后sos2-2中的YFP信号显著降低。故SOS2在转录后水平上调控PLT1/2，进而调控盐胁迫下根分生茎的维持。
图2. SOS2通过维持PLETHORA (PLT)1/2蛋白来调节根分生组织活性
图3. SOS2与PLT1/2相互作用，通过磷酸化增强盐胁迫下PLT1/2蛋白的稳定性
3、SOS2与PLT1/2相互作用并通过磷酸化调节盐胁迫下蛋白质的稳定性
为了研究SOS2是否直接调控PLT1/2，实验检测了SOS2和PLT1/2之间的相互作用。根据萤火虫荧光素酶(LUC)互补成像分析显示，植物中PLT1和PLT2均与SOS2相互作用。Split-YFP测定证实了SOS2与PLT1/2在细胞核中的相互作用。实验假设PLT1/2可能是SOS2的底物，过程中纯化重组His-SOS2并进行了体外磷酸化实验。His-SOS2可以磷酸化麦芽糖结合蛋白(MBP)-PLT1和MBP- plt2，但不能够磷酸化MBP蛋白本身。
进一步将PLT1/2蛋白拆分为三个功能性的区域(n端、中央端和c端)，发现重组MBP-PLT1/2的c端区域分别在His-SOS2培养中被强烈的磷酸化。实验通过质谱分析探索了PLT1/2磷酸化位点，并查找了拟南芥蛋白磷酸化位点数据库的相关数据。PLT1的Ser401-Thr402-Ser403-Ser404(PLT1S4)与PLT2的Ser411-Ser412-Ser413(PLT2SS)同源，SOS2选择了四个氨基酸残基作为潜在的磷酸化位点。
将这些氨基酸突变为丙氨酸(PLT1SAA和PLT2S3A)，并且进行了体外磷酸化测定。实验结果发现His-SOS2对MBP-PLT1SAA和MBP-PLT2S3A的磷酸化降低，表明SOS2至少部分通过这些位点去磷酸化PLT1/2。
这些结果表明SOS2与PLT1/2蛋白相互作用，SOS2通过PLT1/2的c端结构区域磷酸化PLT1/2。
相关实验研究了PLT1/2磷酸化是否通过SOS2，通过在体内和体外进行降解试验去改变相关蛋白质的稳定性。将WT和sos2-2背景下的PLT2pro:: PLT1-YFP和PLT2pro::PLT2-YFP分别作±NaCl处理，并且进行免疫印迹分析实验。NaCl处理后sos2-2中PLT1-YFP和PLT2-YFP的丰度均降低。LUC互补成像分析显示，SOS2可以和PLT1/ 2W及模拟磷酸化的PLT1S4E/PLT2S3E相互作用，但与不具有磷酸化活性的PLT1S4A/PLT2S3A^相互作用较弱。实验通过体外无细胞实验进一步证实SOS2对PLT1/2体外稳定性的影响。无NaCl处理，重组MBP-PLT1/2蛋白在sos2-2突变体的蛋白提取物中表现出与WT相似的稳定性。
重组MBP-PLT1/2蛋白在盐胁迫下在WT提取物中稳定，但在NaCl处理的sos2-2提取物中降解迅速。当分别加入蛋白酶体抑制剂MG132和MG115时，NaCl对sos2-2提取物中PLT1/2的降解有强烈的抑制作用。自噬抑制剂3MA(3-甲基)也抑制了PLT1/2的降解，表明NaCl处理后PLT1/2不仅仅通过26S蛋白酶体降解，还通过自噬途径降解。
接下来的实验探讨了PLT1/2磷酸化对其蛋白稳定性有何作用。在盐胁迫下，sos2-2突变体中，模拟磷酸化PLT1S4D/PLT2SSE蛋白要比非磷酸化PLT1SAA/PLT2SSA蛋白更加稳定。进一步分别在盐胁迫和无盐胁迫下拍摄了PLT蛋白定位WT和磷酸化模拟/敲除变体的显微镜图像。图像表明：NaCl处理不会影响PLT1/2蛋白定位。故结果表明SOS2介导的PLT1S4/PLT2SS磷酸化抑制了盐胁迫下蛋白质的降解。
图4. PLT2磷酸化是SOS2介导的盐胁迫下分生组织维持和初生根生长所必需的
4、PLT1/2磷酸化维持根分生组织在盐胁迫下的活性
实验中制备了拟磷酸系以及无磷酸系，并分别与sos2-2突变体组合。实验发现拟磷酸系植株磷酸化部分挽救了NaCl处理后sos2-2的分生组织和主根长度减少。无磷酸化系表现出分生组织和初生根长度减少。为了确认SOS2-PLT1/2模块是否调控NaCl处理后的根分生组织细胞分裂，作者对WT (gl1)、sos2-2和sos2-2 PLT1/2拟磷酸系和无磷酸系的根分生组织进行了5-乙基-20脱氧尿苷(Edu)染色。
NaCl处理后，sos2-2突变体中Edu标记的细胞数量大幅减少。共聚焦图像和Edu标记细胞数量的定量分析均显示，拟磷酸化的PLT1/2 (PLT1S4D/PLT2SSE)可以部分挽救sos2-2中Edu标记细胞数量的减少，表明SOS2-PLT1/2模块调节盐胁迫下根分生组织细胞的分裂。此外，根尖RNA-seg数据显示，与WT相比，盐胁迫下sos2-2中编码细胞分裂调节因子数量的转录显著减少。与RNA-seg数据一致，CYCB1;1, CCS52A, CYCD3;3基因在NaCl处理后sos2-2的表达显著降低。NaCl处理后的sos2-2系中，PLT1/2的拟磷酸化版本而无磷酸化版本补充了细胞周期基因的减少。
为了研究盐胁迫下这些基因型的SCN活性是否受到影响，作者对WT (gl1)、sos2-2、PLT1/2S4E/A sos2-2系进行了改良的碘化丙烯(mPS-PI)染色，并对SCN区域进行了共聚焦成像观察。不同基因型细胞的SCN组织和QC细胞数量在NaCl处理和无NaCl处理下均没有明显变化。综上所述，SOS2-PLT1/2调控盐胁迫下根分生组织的细胞分裂。
为了进一步证实PLT1和PLT2磷酸化模拟物是否能增强对高盐胁迫的抗性，作者将pPLT1::GFP-PLT1S4D sos2-2与pPLT2杂交。: GFP-PLT2S3E sos2-2。pPLT1。:GFP-PLT1S4D pPLT2:GFP-PLT2S3E sos2-2系在25 mM NaCl和50 mM NaCl处理下均能较好地恢复sos2-2的主根和分生组织长度，说明PLT1和PLT2在盐胁迫下具有加性作用。
接下来，作者进行互补测试并转化pPLT1:GFP-PLT1S4D, pPLT2::GFP-PLT2S3E, pPLT1、: GFP-PLT1S4A PPLT2、:GFP-PLT2S3A、pPLT1::GFP-PLT1和pPLT2::GFP-PLT2构建到plt1-4 - plt2-2双突变的背景下，观察到所有的构建体在没有盐胁迫的情况下都恢复了plt1-4 - plt2-2的分生组织和根长缺陷。作者发现pPLT1增强了分生组织、主根长度和GFP强度的减少。:GFP-PLT1S4A plt1-4 plt2-2和pPLT2::GFP-PLT2S3A plt1-4 pIt2-2，与相应的拟磷系比较。综上所述，这些结果表明PLT1S4/PLT2SS磷酸化是NaCl处理下根分生组织维持所必需的。
图5. 互补分析显示，与盐胁迫后的磷酸失活形式相比，plt1-4和plt2-2中的磷酸模拟PLT 2形式具有更好的互补
5、SOS2介导的PLT1/2的磷酸化在盐胁迫缓解后促进初级根生长的恢复
为在更长的时间尺度上测定PLT拟磷酸化系和无磷酸化系的耐NaCl性，作者用含NaCl的水进行了土壤试验，sos2-2中PLT1/2拟磷系在延长的盐胁迫下表现出更强的抗性。相反，与土壤中的sos2-2相比，sos2-2中磷酸化失活版本的PLT1/2表现出相似的表型，表明在盐胁迫下更稳定的PLT1/2蛋白也可以帮助整个植物应对土壤中的盐胁迫。
接下来讨论PLT1/2的稳定性，也就是受SOS2介导的磷酸化调控，影响盐胁迫缓解后初生根生长的恢复。作者播种了WT, sos2-2, pPLT1。:GFP-PLT1S4D sos2-2、pPLT1::GFP-PLTHSAA sos2-2、pPLT2:GFP-PLT2SSE sos2-2、pPLT2。GFP-PLT2SSA sos2-2种子在加或不加NaCl的1/2 MS培养基上，然后将萌发4天的幼苗转移到1/2 MS培养基上恢复。在恢复生长1天后， sos2-2、pPLTi::GFP-PLT1S4A sos2-2和pPLT2:GFP-PLT2SBA sos2-2的根分生组织长度仍然比WT短。同样， GFP-PLTHSAA和GFP-PLT2SSA在恢复生长1天后的表达量低于模拟处理。
另一方面，pPLT1::GFP-PLT1S4D sos2-2和pPLT2::GFP-PLT2SSE sos2-2的根分生组织长度和GFP-PLT1S4D和GFP-PLT2SSE的表达均恢复，与模拟处理相似。时间过程分析进一步证实了sos2-2和磷酸化失活pPLT1的分生组织长度和初生根生长。:GFP-PLTIS4A sos2-2和pPLT2::GFP-PLT2S3A sos2-2比WT和拟磷酸化的pPLT1恢复慢。:GFP-PLTYS4D sos2-2和pPLT2::GFP-PLT2SSE sos2-2线。延长恢复实验发现sos2-2和磷酸化失活的pPLT1。:GFP-PLT1S4A、sos2-2和pPLT2。:GFP-PLT2S3A sos2-2系在脉冲NaCl处理后恢复不佳，而拟磷酸化的pPLT1的茎和根均恢复良好。:GFP-PLT1SAD sos2-2和pPLT2:GFP-PLT2SE sos2-2与sos2-2和无磷酸化pPLT1相比恢复明显更好。
研究结果表明，在短暂盐胁迫下，SOS2磷酸化并稳定PLT1/2，有助于植物根和芽在盐胁迫缓解后更快地恢复。
图6. SOS2介导的PLT1/2磷酸化促进盐胁迫缓解后初生根的恢复
讨论：
实验证明盐胁迫下根分生组织需要SOS2-PLT1/2蛋白维持。在盐胁迫下SOS2在转录后调控PLT1/2蛋白，通过PLT1/2蛋白的C端磷酸化进一步稳定PLT1/2。盐胁迫下磷酸化的PLT1/2能维持根分生组织的活性和根的生长。SOS2调节PLT1/2磷酸化还会有助于植物芽和根在短暂盐胁迫下快速恢复。高水平的PLT蛋白决定干细胞的特性，中水平PLT促进分生细胞的分裂活性，低水平PLT是细胞分化的必要条件。
在正常情况下，无磷酸化和拟磷酸化的PLT1/2都能修复plt1-4plt2-2的分生组织和根缺陷，无磷酸化的PLT1/2在盐胁迫下加剧分生组织和根的减短。PLT1S4/PLT2S3磷酸化位点仅在PLT1/2之间存在，在其他PLT不存在，证明PLT1/2是在盐胁迫下SOS通路维持根分生组织的特异性靶点。拟磷酸化PLT1/2可以部分挽救在轻度盐胁迫下sos2-2分生组织和初生根的减短。本实验使用温和的Nacl浓度，而SOS2激酶活性是以盐浓度依赖的方式诱导。进一步的研究应解决在高盐条件下SOS2-PLT1/2蛋白模块如何调节根分生组织分化的问题。
SOS2介导的PLT1/2的磷酸化，磷酸化的位点的个数是否对SOS2-PLT1/2模块维持根分生组织活性造成影响？是否可以通过增加或减少c端区域磷酸化位点使得根生长受人为控制和影响呢？在n端，中央端，c端三个不同的功能区域上，若SOS2发生突变通过PLT1/2的其他区域磷酸化PLT1/2是否还能使根分生组织保持活性？实验还探究了1/2MS、50mM NaCl、100mM NaCl等条件下SOS2-PLT1/2模块的作用，该模块可作用的盐浓度具体范围为多大，是否可以探究出？求出该模块的最大可耐盐浓度也许会有利于未来对盐碱地的治理开发和利用。实验中，是否检测在盐胁迫开始至结束后恢复生长的过程中，根部相关蛋白的含量变化，以此更好地得到更加直观的数据？
校稿排版：刘俊杰
