2023年8月30日，海南大学热带农林学院、海南省热带生物资源可持续利用重点实验室陶均团队在Plant Physiology上，在线发表了一篇名为“Arabidopsis membrane protein AMAR1 interaction with type III effector XopAM triggers a hypersensitive response”的研究论文。本研究表明，低脂肪酶活性可能会改变作物的膜通透性，揭示了XopAM作为一种脂肪酶在植物AMAR1的帮助下导致细胞凋亡的机制。
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植物为了检测和应对入侵的病原体，进化出了两层复杂的监控系统，病原相关分子模式(PAMP)触发免疫(PTI)和效应蛋白触发免疫(ETI)。在ETI免疫应答中，核苷酸结合富含亮氨酸的重复受体（NLR）是直接或间接与Ⅲ型效应子（T3Es）相互作用以转导信号和激活下游免疫应答所不可或缺的。NLR诱导的ETI通常伴随着植物过敏反应（HR），这在限制病原体增殖和感染方面起着非常重要的作用。被T3Es激活的NLRs不仅会导致HR的发生，还会导致细胞内Ca2+流动、水杨酸（SA）产生、活性氧（ROS）迸发和一氧化氮的产生。随着这些免疫信号分子在植物体内的产生，可以激活致病相关基因(PRs)的表达和下游防御反应，实现局部到全局、短暂到持续的防御效应。在病原体与植物的相互作用过程中，病原体还进化出各种分泌系统和众多效应物，以促进感染。黄单胞菌是一组致命的革兰氏阴性植物病原细菌，其毒力依赖于III型分泌系统(T3SS)分泌的III型效应物(T3Es)。经过与寄主植物的长期共同进化，T3Es在黄单胞菌中的功能发生了变化。几乎每一种T3Es都通过独特的机制与宿主植物相互作用，但大多数T3Es都参与抑制 PTI。同时，一些T3Es也抑制ETI。野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc)可引起十字花科作物发生黑腐病，在世界范围内造成巨大的经济损失。Xcc对植物的侵害依赖于其自身的Ⅲ型分泌系统。在Xcc 8004基因组中，有34个假定的编码T3Es的基因，但只有少数基因，包括 XopAC、XopD、XopL 和 XopN。XopAM启动子具有典型的TTCG-N16null-TTCG植物诱导启动子盒(PIP BOX)，是III型调节因子HrpX的结合位点。与XopAC相比，XopAM对拟南芥Col-0具有有限的无毒作用。与拟南芥中的xopAC突变体相比，xopAC突变体中的xopAM突变并没有显著增加症状的发展，这表明xopAM对xopAC是上位性的。就细菌生长速度而言，双突变体与xopAC突变体相似。因此，XopAM是拟南芥Xcc毒性的重要决定因素，并可能靶向未知蛋白触发植物防御反应。XopAM属于AvrE家族T3Es。已报道的AvrE-T3Es，包括PopS、DspA/E、AvrE和HopR1，广泛分布于Ralstonia, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas等植物病原菌中。PopS、DspA/E、AvrE和HopR1调节SA介导的植物防御反应并抑制PTI。在Ralstonia中，PopS通过抑制SA的积累来干扰植物的免疫系统。在Erwinia中，DspA/E通过激活蛋白磷酸酶2A和灭活丝氨酸棕榈酰基转移酶来调节植物细胞中鞘脂的生物合成。在Pseudomonas中，AvrE可诱导宿主和非宿主植物的细胞坏死，而AvrE和HopR1均抑制SA通路和PTI反应，可能是由拟南芥中的CNL（CAR1）介导的。此外，最近的一项研究表明，Pseudomonas AvrE以1型蛋白磷酸酶（TOPPs）为靶点，阻断ABA信号通路，影响气孔关闭，增强植物水分浸泡和病害。这些结果表明，不同的AvrE成员具有不同的宿主靶点，1个AvrE-T3E可能具有一个以上的宿主靶点，它们可以调节不同的免疫通路。值得注意的是，XopAM调控Xcc-植物相互作用的机制尚未见报道在本研究中，作者发现XopAM在十字花科作物中是一种强毒的AvrE-T3E，但在拟南芥中是无毒的。还发现了一个XopAM靶点(XopAM-activated RESISTANCE1, AMAR1)，它对于 XopAM在拟南芥中的无毒功能是必不可少的。此外，XopAM作为一种脂肪酶可能影响细胞膜脂质。AMAR1可增强植物体内溶脂和神经酰胺(Certs)的活性，从而激活植物免疫应答和HR细胞死亡，从而抑制Xcc感染。由于驯化的十字花科作物的AMAR1同源基因不识别XopAM从而有利于细菌感染。本研究揭示了，低脂肪酶活性可能会改变这些作物的膜通透性，XopAM作为一种脂肪酶在植物AMAR1的帮助下导致细胞死亡的机制。1. XopAM是Xcc在驯化十字花科作物中有效感染所必需的AvrE-T3Es家族广泛存在于植物致病菌中。为了了解这些蛋白之间的系统发育关系，作者基于XopAM、HopR1、PopS、AvrE和DspE的蛋白序列建立了最大似然系统发育树，发现该T3Es家族形成了3个不同的簇：AvrE/DspE、PopS和HopR1/XopAM（图1A）。除XopAM外，这些T3Es的功能已被研究。为了研究XopAM在Xcc毒力中的作用，将xopAM缺失突变体(ΔxopAM)和相应的互补菌株(CΔxopAM)与野生型菌株Xcc 8004在十字花科作物包括卷心菜(Brassica oleracea L.)、胡萝卜(Raphanus sativus L.)和西兰花(B. oleraceavar. botrytis)中的毒力进行了比较。图1. XopAM是十字花科作物中一种细胞膜定位的强毒性AvrE-T3E。A)XopAM同源物的系统发育树。采用MEGA11（最大似然法）分别分析了黄单胞菌、假单胞菌的XopAM、PopS、HopR1、AvrE和DspE。XopAM和HopR1形成1个分支，其他AvrE-T3Es形成另一个分支。B)~D)以15 dpi测定白菜(B)、西兰花(C)和胡萝卜(D).的病变长度数据分析采用Tukey多重均值比较检验方法的单因素方差分析（n = 9，P < 0.05）。具有症状的对称正态分布曲线的盒形图表示如下：中间条形、中位数；盒限、上、下四分位数；以及极值、最小值和最大值。这些图像被数字提取出来进行比较。这些实验被独立地重复了两次。E)XopAM的亚细胞定位。用激光扫描共聚焦显微镜分析了与农杆菌转化36~48h后的本氏孢杆菌叶肉细胞。FM 4-64作为pm特异性染料。用ImageJ 1.53k和ScatterJ（版本1.04）对照片进行分析，皮尔逊相关系数表明存在荧光重叠的可能性。条形图表示25 μm的长度。
接种后15 d, Xcc 8004或CΔxopAM在白菜中引起的病变长度约为4.0cm，而ΔxopAM引起的病变长度仅为~1.5 cm（图1B）。在西兰花中，Xcc 8004或CΔxopAM引起的病变长度约为3.0 cm，而ΔxopAM引起的病变长度为~ 1.5 cm(图1C)。Xcc 8004、ΔxopAM和CΔxopAM在胡萝卜中引起的病变长度分别约为~2.4 cm、1.0 cm 和 2.2 cm(图1D)。这些结果表明，XopAM是Xcc天然作物宿主的强毒力AvrE-T3E。
由于效应蛋白的亚细胞定位是其在细菌-植物相互作用中的功能的良好指标，作者首先确定了XopAM在植物细胞中的亚细胞定位。通过农杆菌介导的转化，XopAM- gfp在烟叶叶肉细胞中瞬时表达。发现XopAM- gfp可能定位于细胞膜。为了证实XopAM的亚细胞定位，作者用一种特殊的细胞膜染料FM4-64对转化后的本氏烟草叶肉细胞进行染色，XopAM- gfp荧光与FM4-64重叠，Pearson相关系数值为0.81 (r=0.81)(图1E)，表明XopAM定位于本氏烟草叶肉细胞的质膜(PM)，并可能在PM上发挥生物学功能。
2. XopAM在拟南芥中引发强烈的HR-like细胞死亡为了进一步分析XopAM在植物中的生物功能，以拟南芥为植物材料。研究者试图分析XopAM在拟南芥(Col-0)原生质体中的亚细胞定位，但是没有获得表达XopAM-gfp的原生质体，这意味着XopAM可能对拟南芥细胞有毒。然而，当XopAM1-692或XopAM1753-2049片段（截断的XopAM 1-692 aa和1753-2049aa）与GFP融合时，我们获得了具有绿色荧光的原生质体，但未观察到这些蛋白的特异性亚细胞定位信号，表明细胞膜定位信号并不位于XopAM的N端或C端，XopAM的全长可能对其在拟南芥中的活性至关重要。由于没有获得表达XopAM的转基因拟南芥以及表达XopAM-gfp的原生质体，所以假设XopAM过表达对拟南芥具有致死性。因此，研究者构建了雌二醇诱导的XopAM转基因拟南芥(IE-xopAM)，并在雌二醇诱导下检测其表型。正如预期的那样，IE-xopAM种子在含有雌二醇的培养基中不能萌发，诱导24小时后雌二醇诱导叶片出现强烈的HR-like细胞死亡(图2, A至C)，表明XopAM可以诱导拟南芥细胞死亡。这些表型可以解释为什么不能获得原生质体和转基因植物组成表达XopAM。图2. XopAM在拟南芥中与AMAR1相互作用。A)将IE-xopAM和IE-gfp的种子种植在添加5μMβ-雌二醇的1/2 MS平板上，8d后拍照。实线表示根的长度。实验重复了3次，结果相似。B)在雌二醇诱导8d后测定其发芽率。数据以SD（±SD）的均值表示，采用双向方差分析，然后进行Tukey检验（n = 3，P < 0.01）。C)在细胞坏死试验中，将种植在土壤中的28日龄幼苗喷洒50μMβ-雌二醇，并拍照24h。对于IE-xopAM叶片诱导切片，坏死细胞区域用箭头表示。这些图像被数字提取出来进行比较。实验重复了3次，结果相似。将D) XopAM和AMAR1（或截断的AMAR1173-647）与酵母GAL4的BD（DNA结合域）或AD（转录活性域）融合，共转化为Y2H金菌株。在选择性的培养基板上发现得到的菌株，并在培养3d后拍摄。-TL，缺Trp、Leu。-TLHA，（缺Trp，Leu，His，和Ade）。SD，综合定义的介质。E)采用GST下拉法分析XopAM与AMAR1173-647的相互作用。通过使用抗his和抗gst抗体，采用免疫印迹法证实His6-XopAM和GST-AMAR1173-647的相互作用。CBB，考马斯亮蓝染色。F)BiFC检测验证了XopAM和AMAR1在本氏杆菌叶肉细胞中的相互作用。将含有XopAM和AMAR1表达载体的农杆菌共注射到本氏农杆菌叶片中，在36~48hpi下用激光扫描共聚焦显微镜拍照。以XopAC-BIK1对作为阳性对照。标尺=25 μm。
3. XopAM作为一种无毒的T3E，在拟南芥中与AMAR1相互作用为了研究XopAM在拟南芥中的功能，比较Xcc 8004、ΔxopAM和CΔxopAM在拟南芥Col-0中的毒力。可以观察到ΔxopAM比Xcc 8004和CΔxopAM引起更强的黄化，表明XopAM在拟南芥中起无毒效应，这与十字花科作物中获得的结果相反，但与之前的发现一致。这些数据表明，拟南芥成分可能影响XopAM活性，或者XopAM通过拟南芥中的靶蛋白激活免疫。为了鉴定植物细胞中潜在的XopAM靶蛋白，以全长XopAM为诱饵，以拟南芥cDNA文库为猎物，进行酵母2杂交(Y2H)筛选。经过3次筛选，每次筛选∼10-6个菌落，将捕获的猎物经点对点Y2H检测确认后，共对10个阳性克隆进行测序。将AT1G80280的小肽(417~584 aa)被鉴定为XopAM的相互作用物。AT1G80280具有跨膜(TM)结构域和α/β 水解酶(ABH)保守结构域，可能在基础代谢中发挥重要作用。使用截断的没有TM结构域的AT1G80280再次进行Y2H，发现它可以与XopAM相互作用(图2D)并将AT1G80280重新命名为AMAR1。为了进一步证实这种相互作用，进行了谷胱甘肽s-转移酶(GST)下拉试验。GST-AMAR1173-647和His6-XopAM在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化。每种纯化蛋白各20微克混合(His6-XopAM/GST, His6-XopAM/GST-AMAR1173-647, 和His6-XopAM)在25℃下孵育3小时，然后用GST磁珠在4℃下孵育4小时。如图2E所示，GST-AMAR1173-647能够与His6-XopAM结合，这表明在体外两种蛋白之间存在相互作用。为了证实XopAM和AMAR1在植物中的相互作用，我们通过农杆菌介导的转化对本氏进行了双分子荧光互补（BiFC）分析。。XopAM和AMAR1分别与黄色荧光蛋白（YFPN）的非荧光N端部分和YFP（YFPC）的C端部分融合。以细胞膜中的葡萄孢菌诱导的激酶1（BIK1）-XopAC作为阳性对照。BIK1-YFPN与XopAM-YFPC或AMAR 1/AMAR 1173 -647-YFPN与XopAC-YFPC的组合未诱导荧光。相比之下，当表达BIK1-YFPN与XopAC-YFPC和AMAR 1/AMAR 1173-647-YFPN与XopAM-YFPC的组合时，观察到强YFP荧光，表明XopAM-AMAR 1在植物细胞中相互作用（图2F）。根据XopAM的PM定位，XopAM-AMAR1 BiFC实验中的YFP信号似乎局限于PM。4. XopAM诱导的拟南芥抗病性依赖于AMAR1为了证实AMAR1与XopAM的相互作用可能是XopAM在拟南芥中发挥无毒效应的原因这一观点，作者比较了Col0和AMAR1基因突变体（amar1）与Xcc的抗性，发现Col0的褪绿能力较弱，而amar1在接种Xcc 8004和CΔxopAM6d后出现坏死。然而，ΔxopAM在Col-0中的感染能力高于amar1（图3、A和B）。这些结果表明，amar1对Xcc 8004和CΔxopAM的敏感性是由于AMAR1缺失所致，而AMAR1可能是XopAM的同源R蛋白。AMAR1同源物广泛分布于十字花科，包括卷心菜、胡萝卜、西兰花和拟南芥等。作者通过Y2H检测XopAM和AMAR1同源物的相互作用。同时为了避免TM结构域的影响，在相互作用实验中，如果这些AMAR1同源物有TM结构域，则删除它们。结果显示，所有这些测试的AMAR1同源蛋白都不与XopAM相互作用，这可能解释了为什么Xcc中XopAM缺失导致十字花科作物和拟南芥之间相反的表型。另一方面，AvrE-T3Es也存在于多种植物细菌性病原体中。研究者还测试了AMAR1和XopAM同源物的相互作用，发现AMAR1可以特异性地与Xcc的XopAM相互作用，而不是与其他植物病原体的同源物相互作用，促使研究AMAR1赋予拟南芥的抗性是Xcc特异性抗性还是广谱抗性。因此，分析了Col-0和AMAR1对Pseudomonas syringae pv tomato DC 3000(Pst DC 3000，具有XopAM同源物AvrE和HopR1)的抗性，发现Col-0和AMAR1之间没有差异，表明AMAR1可能是一种特异性抗Xcc 蛋白。综上所述，这些数据表明XopAM特异性地针对AMAR1，并导致拟南芥对Xcc的抗性。由于XopAM定位于PM（图1E），BiFC结果证实XopAM和AMAR1也在细胞膜上相互作用（图2F）。在通过TMHMM和SMART分析后，作者构建了AMAR1的三维结构以进一步预测其生物功能。它在其外围具有5个TM，在中心具有ABH结构域（图3C）。然后确定了它的亚细胞定位。AMAR1-GFP主要定位于在本氏烟草叶肉细胞中观察到的结果（图3D），这与先前BiFC测定中观察到的结果一致。TM结构域截断蛋白（AMAR 1173-647）没有特异性亚细胞定位，表明TM结构域对AMAR 1在植物细胞中的亚细胞定位至关重要（图3D）。这些结果表明，AMAR1是ABH家族的细胞膜蛋白，并在细胞质膜上与XopAM相互作用。图3. AMAR1是一种细胞质膜蛋白，是XopAM诱导的抗性所必需的。A)用Xcc 8004、ΔxopAM和CΔxopAM感染拟南芥Col-0和amar1，分析其疾病表型。B)疾病水平（疾病指数：0至1，无症状；1至2，褪绿弱，2至3，褪绿强，坏死3至4），以6 dpi计算。所示数据采用Tukey的多重均值比较检验方法进行双向方差分析（n= 12，p< 0.05）。症状的半盒图表示如下：小方形、中位数；框上限和下四分位数；极值、最小值和最大值，所有计算值都在右侧。实验进行了3次，结果相似。C)分别通过AlphaFold2和蛋白质结构数据库预测其三维结构和保守结构域。D)AMAR1和AMAR1173-647在本氏烟草叶肉细胞中的亚细胞定位。采用FM 4-64作为PM染料。照片用ImageJ 1.53k和ScatterJ进行分析，版本1.04，皮尔逊相关系数表明存在荧光重叠的可能性。条形图表示25 μm的长度。6. XopAM诱导的拟南芥免疫应答依赖于AMAR1由于xopAM表达会导致Col-0细胞坏死。作者也通过台盼蓝染色实验证实了这些结果。IE-xopAM（Col-0中xopAM的可诱导表达）叶片在0至6h几乎不被台盼蓝染色，但在12和24 hai被染色，而IE-gfp（Col-0中gfp的可诱导表达）在0至24 h不能被染色，这意味着大量的细胞坏死被XopAM诱导（图4，A和B）。ETI触发的HR细胞死亡伴随ROS爆发。为了检查ROS是否也在XopAM表达期间积累，通过3，3-二氨基联苯胺（DAB）染色测定来测定ROS含量。结果显示，IE-gfp在0至24h未被DAB染色，而IE-xopAM在12和24h染色，表明XopAM可以诱导Col-0中的ROS爆发（图4，C和D）。ROS迸发过程与细胞坏死时间轴一致，表明XopAM诱导的ROS爆发可能促进Col-0中的细胞坏死。由于AMAR1特异性地与XopAM相互作用，研究者研究了AMAR1是否参与拟南芥中XopAM触发的细胞坏死。首先，XopAM在Col-0和amar1叶片中瞬时表达，并将植物叶片用台盼蓝染色。结果表明，XopAM诱导的amar1与Col-0叶中的相比叶片细胞坏死程度较轻，表明XopAM触发的细胞坏死依赖于拟南芥中的AMAR1。为了进一步阐明XopAM触发的HR细胞死亡与AMAR1之间的关系，还构建了转基因拟南芥系amar1-IE-xopAM和amar1-IE-gfp。比较了β-雌二醇诱导后IE-gfp、IE-xopAM、amar1-IE-gfp和amar1-IE-xopAM之间的细胞坏死。在这些植物中，仅IE-xopAM在诱导后3天后表现出HR反应，但在amar1-IE-xopAM中在第7天也发现失绿（图4E），表明XopAM也可以在不存在AMAR1的情况下诱导细胞死亡。还比较了雌二醇诱导后这些植物中的ROS水平，并且在24h时在IE-xopAM中观察到强烈的ROS爆发，而在amar1-IE-xopAM中没有观察到（图4F）。总之，数据表明，XopAM诱导的HR在拟南芥中被AMAR1激活。图4. AMAR1和XopAM在拟南芥中协同触发HR-like细胞死亡。A)和B)采用台盼蓝染色法检测IE-gfp和IE-xopAM的叶片细胞坏死水平。对28日龄植株幼苗喷洒50μMβ-雌二醇，收获叶片，在不同区域用台盼蓝染色。C)和D)IE-gfp和IE-xopAM叶片中ROS爆发水平也通过DAB染色检测。数据显示为双向方差分析的平均±标准差，然后是Tukey检验（n=9，P<0.05）。错误条表示± SD。E)IE-gfp、IE-xopAM、amar1-IE-gfp和amar1-IE-xopAM在3代和7d时发生叶片坏死。通过DAB染色测定了在24和48 h时上述植物叶片的F) ROS爆发水平。数据显示为双向方差分析的平均±标准差，然后是Tukey检验（n=9，P < 0.05）。错误条表示±SD。用ImageJ 1.53k对照片进行分析，数据为3株植物至少9叶在每个时间点每片叶片的平均染色强度。实验独立重复3次。7. XopAM作为脂肪酶发挥功能，其活性可通过AMAR1在体内增强
研究XopAM时，在本氏烟草中也发现了明显的细胞坏死。当XopAM-GFP在接种后36至48小时表达时，在本氏烟草叶片中观察到明显的变化，而在表达GFP的位点中没有观察到可见的变化（图5，A和B）。由于XopAM表达也导致拟南芥Col-0中强烈的ROS爆发和快速的细胞死亡，但在AMAR1中仅轻微，假设XopAM和/或AMAR1可能具有HR诱导所必需的特殊生物化学活性。ABH蛋白存在于生命的所有领域，并且它们中的大多数在生物代谢中具有催化作用，这表明AMAR1可能具有这些酶活性。
考虑到XopAM和AMAR1位于PM上，并且可以在拟南芥中触发强HR，假设XopAM和/或AMAR1可以作为靶向PM组分的酶。比较了IE-gfp、IE-xopAM、amar1-IE-gfp和amar1-IE-xopAM在β-雌二醇诱导下的脂质组分。与IE-gfp、amar1-IE-gfp和amar1-IE-xopAM相比，IE-xopAM在雌二醇诱导下Cert、溶血磷脂（LPL）和三酰甘油（TG）水平显著升高，而膜极性脂质包括单半乳糖甘油酯（MGDG）、双半乳糖基二酰甘油（DGDG）、二酰甘油N，N，N-三甲基高丝氨酸（DGTS）、磺基喹诺酮基二酰甘油（SQDG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰肌醇（PI）显著减少（图5C）。
极性脂质的多不饱和脂肪酸（PUFA）通常是植物胁迫下TG中多种PUFA的来源，PUFA存在于极性脂质中，但一旦植物遇到不利条件，它们可能会从极性脂质流向TG。事实上，雌二醇诱导后，含PUFA和极性脂质溶血衍生物的TG显著增加，同时沿着IE-xopAM中极性脂质减少（图5，D和E）。因此，XopAM-AMAR1模块参与极性脂质水解成其溶血脂质衍生物和转化为TG的PUFA。
图5. XopAM-AMAR1影响拟南芥的脂质代谢。A) XopAM的表达导致本氏杆菌叶片坏死。将含有XopAM-GFP和GFP表达载体的农杆菌注入本氏菌叶片，36 h拍摄叶片。该图像被数字提取出来进行比较。B)表达XopAM-GFP和GFP的本氏草叶的坏死面积比。照片采用ImageJ 1.53k进行分析，所示数据采用t检验方法进行分析（n = 5，P < 0.05，误差条表示± SD）。C)在β-雌二醇诱导下，IE-gfp、amar1-IE-gfp、IE-xopAM和amar1-IE-xopAM脂质类型和含量。D)被测植物叶片中TG与多不饱和脂肪酸的相对含量。E)4株试验植物的总游离脂肪酸（FFAs）。数据显示为双向方差分析的平均±标准差，然后是Tukey检验（n = 4，P < 0.05）。TG: 三酰基甘油。用于脂质组学分析的样本是在用β-雌2醇诱导24-48小时后采集自28日龄的植株。为了测试AMAR1和XopAM是否具有脂肪酶活性，使用对硝基苯基丁酸酯（pNPB）作为底物。发现XopAM可以将pNPB水解成对硝基苯酚（pNP），酶活性为1.0U（图6A），表明它是脂肪酶。由于XopAM是一种大蛋白质，具有2049个氨基酸，分子量约为220 kDa，并且没有已知的结构域，故无法预测哪个片段包含酶活性结构域。因此，分析了XopAM的N-末端（1至1024 aa）和C-末端（1025至2049 aa）片段的脂肪酶活性，发现N-和C片段都没有脂肪酶活性（图6B），表明XopAM是脂肪酶，其活性可能需要全长结构。这些数据表明，XopAM可能扰乱脂质体内平衡过程中Xcc-植物的相互作用。当只有AMAR1和XopAM共存时，植物表现出强烈的细胞死亡。因此，测试了AMAR1是否也是脂肪酶，或者XopAM的脂肪酶活性是否受AMAR 1调节。由于AMAR1（AMAR 1173 -647）的C-末端可以与XopAM相互作用，首先测试了该结构域对XopAM活性的影响。结果XopAM的脂肪酶活性不受AMAR 1173 -647的调节。这也证明AMAR 1173 -647不是脂肪酶。由于AMAR1是一种细胞膜蛋白，TM结构域可能对AMAR1功能至关重要。上述数据暗示XopAM可能作为PLA2-LIKE酶起作用，其将极性脂质水解成其溶血脂质衍生物。当AMAR1和XopAM共存时，Cert含量也显著增加，并且己糖神经酰胺（HexCers）减少（图6F）。这些数据表明，AMAR1-XopAM模块参与调节鞘脂代谢。由于AMAR1是一个假定的水解酶和XopAM作为脂肪酶，AMAR1和/或XopAM作为鞘磷脂酶的功能。然而，无法在体外检测到AMAR 1173 -647和XopAM的任何鞘磷脂酶活性，但不能排除AMAR1或XopAM作为鞘磷脂酶发挥作用。数据表明，XopAM的活性可以增强AMAR1在体内和极性脂质和鞘脂代谢的AMAR1-XopAM模块的调节是至关重要的拟南芥细胞死亡。图6. XopAM可能是一种PLA2，它会增加Cert的含量。A)和B)XopAM(A)和截断片段XopAMN（1~1024aa）和XopAMC（1025~2049aa）(B)的脂酶活性。数据分析采用Tukey多重均值± SD比较检验方法的单因素方差分析（n = 3，P < 0.05）。酶活性单位(U)定义为在405 nm（A405）/μg的蛋白质/mL/min处的1个吸光度。C)含/不含PLA2抑制剂的XopAM和ExoU的脂质酶活性。MAFP，甲基花生酸氟膦酸甲酯。牛血清白蛋白。结果（n = 3）是在A405时每30秒监测和记录的平均±SD。D)和E)在MAFP存在时，由XopAM引起的本氏烟草细胞坏死。用ImageJ 1.53k对照片进行分析。数据分析采用Tukey多重均值± SD比较检验方法的双向方差分析（n = 3，P < 0.05）。这些图像被数字提取出来进行比较。F)被测植物叶片中的总证书含量。数据分析采用Tukey多重平均± SD比较的双向方差分析，不采用组交互分析检验方法（n = 4，P < 0.05）。G)和H)，在24和48 hai时，xopAM表达时PR1和PDF1.2的表达水平。数据分析采用Tukey多重均值± SD比较检验方法的双向方差分析（n = 3，P < 0.05）。abcde代表重要性。
8. XopAM介导的防御相关基因表达的调节被AMAR1增强为了研究AMAR1-XopAM介导植物免疫的途径，分析了β-雌二醇诱导下IE-gfp、IE-xopAM、amar1-IE-gfp和amar1-IE-XopAM中SA激活防御相关标记基因PR1和茉莉酸（JA）及乙烯（ET）激活基因PDF1.2的表达水平。结果显示，雌二醇处理后，IE-xopAM和amar1-IE-xopAM中PR1和PDF1.2的表达水平均显著增加，但IE-xopAM中的倍数增加显著高于amar1-IE-xopAM（图6，G和H）。值得注意的是，这些基因的表达非常低，在诱导过程中IE-gfp和amar1-IE-gfp中的表达水平相当。这些数据表明，AMAR1增强XopAM介导的植物免疫应答。XopAM对PR1和PDF1.2的强烈诱导促使提出AMAR1-XopAM可能调节JA或SA的合成。如预期的，PAD4（调节SA合成）、ACS6（ET合成的关键酶）和LOX3（JA合成的关键酶）的表达水平也显著增加，分别在12、24和48小时后达到峰值。PAD4、ACS6和LOX3的峰值出现在PR1和PDF1.2的峰值之后，表明AMAR1-XopAM可能通过调节SA、JA和ET的合成，诱导防御相关标记基因的表达，从而激活植物免疫。
AvrE-T3Es是植物细胞中的脂肪酶，可能在植物细胞中作为PLA2-like酶，从而影响细胞膜的完整性，诱导宿主和非宿主植物的细胞死亡。XopAM在植物细胞中的生物学功能类似于AvrE；AMAR1可能会增强XopAM的活性；由于AMAR1可以增强XopAM诱导的体内坏死、HR和ROS，AMAR1与XopAM的相互作用可以增强彼此的活性，导致免疫信号的放大。AMAR1-XopAM触发的HR可能依赖于SA-、JA-和et介导的防御通路图7. XopAM-AMAR1信号转导的推测机制模型。当Xcc感染植物时，通过T3SS将XopAM注入植物细胞中。如果植物细胞没有AMAR1，XopAM表现出较低的脂肪酶活性，降低细胞膜的完整性，从而促进细菌感染，引发微弱的免疫反应。因此，植物在Xcc侵染过程中表现出致病性褪绿现象。XopAM作为一种毒性T3E，在这种情况下，植物对Xcc敏感(S)。相反，如果植物细胞表达AMAR1，AMAR1识别XopAM会导致Certs的显著增加，激活下游的免疫反应，包括PR1和PDF1.2的过表达，以及通过水杨酸-茉莉酸（SA-JA）信号通路的ROS的爆发。因此，XopAM-AMAR1触发了强烈的免疫反应，并引起快速和强烈的HR。因此，这些植物具有抗性(R)，而XopAM在AMAR1的存在下作为一种无毒的T3E。TF，转录因子；PL，极性脂质；LPL，lyso-PL。综上所述，作者在本研究中描述了XopAM在Xcc-植物相互作用中的作用，并提出了一个假定的XopAM机制模型（图7）。XopAM是治疗细菌感染的一把双刃剑，它依赖于植物中的AMAR1蛋白。AMAR1同源物不与XopAM相互作用，这可能是XopAM在十字花科作物Xcc侵染过程中作为毒力效应的原因。XopAM具有脂肪酶活性，并能在AMAR1存在时诱导强烈的免疫应答，这表明XopAM在Xcc感染中的作用与宿主不同，AMAR1可能是一个很好的黑腐病育种候选基因。
