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Plant Journal｜lncRNA通过调控靶标mRNA的表达和作为miRNA的内源靶标模拟物来影响花粉的发育

文摘 2024-11-12 21:00 广东

研究背景

在小麦的遗传育种实践中，杀配子染色体(Gc, Gametocidal chromosomes)能够诱导染色体断裂并清除不含该染色体配子，故被广泛用于丰富小麦的遗传背景和增加遗传变异类型。尽管已有研究表明,长链非编码RNA（lncRNA）在调控花粉和花药发育过程中发挥着重要作用，但其在Gc作用中的具体调控机制尚不明确。

因此，为了深入了解小麦杀配子染色体作用过程中lncRNA的功能，最新的研究论文“RNA sequencing and functional analysis uncover key long non-coding RNAs involved in regulating pollen fertility during the process of gametocidal action in wheat”通过RNA测序技术,在中国春小麦(CS,Triticum aestivum cv. Chinese Spring)及其CS-3C单体附加系(Chinese Spring-Gc 3C)的花药组织中，鉴定出大量差异表达的lncRNA。

这些lncRNA不仅通过调控靶标mRNA的表达，还可能通过模拟某些关键microRNA的内源性靶标发挥作用。通过烟草叶片瞬时转化和水稻转化实验，研究人员进一步验证了lncRNA与其靶标mRNA之间的相互作用及其对花粉育性的影响。研究结果揭示了lncRNA在小麦Gc作用过程中的关键功能，为深入理解Gc作用的潜在分子机制提供了新的视角。

科学问题

小麦中的Gc染色体具有“杀伤”和“保护”双重功能，但其分子机制仍未完全解析。已有研究表明,小RNA在Gc作用过程中发挥着关键作用，其中lncRNA通过多种功能机制参与调控花粉、绒毡层及花药的发育。因此，作者希望进一步探讨lncRNA在Gc作用过程中如何调控小麦花粉和花药的发育，并发挥其重要作用。

研究结果

1. lncRNA和mRNA的基本特征

以往的研究表明，携带杂合或半合子Gc染色体的小麦品系，通常会导致育性下降。为了验证这一点，作者通过花粉萌发、TTC染色和I2-KI染色等实验，确认了CS-3C品系的花粉育性下降。研究还指出，在小孢子第一次有丝分裂前的间期，Gc染色体会诱导染色体断裂。基于这一发现，作者收集了该时期的花药组织,设立了对照组(CS)和实验组(CS-3C)。

图1. CS和CS-3C中lncRNA和mRNA的特征

通过深入分析CS和CS-3C品系，成功鉴定到37,778个lncRNA转录本和162,707个mRNA转录本，发现mRNA数量明显高于lncRNA。进一步分析显示，lncRNA转录本较短，而mRNA的最大长度可达50,570bp，且超过54.19%的mRNA长度大于1500bp。此外，大多数lncRNA（69.56%）只有一个外显子，而97.47%的mRNA含有多个外显子。值得注意的是，大部分的lncRNA和mRNA（分别为81.62%和66.55%）仅存在一个转录本。

2. CS和CS-3C之间lncRNA和mRNA的差异表达情况

作者随后通过FPKM方法，分析了每个lncRNA和mRNA转录本的表达水平,最终鉴定出2824个差异表达的lncRNA(DE-lncRNA)和12,824个差异表达的mRNA(DE-mRNA)。为了验证测序数据的准确性，作者随机选取了10个DE-lncRNA和10个DE-mRNA，并采用qRT-PCR分析了它们的表达模式(图2C-D)。

qRT-PCR实验结果表明，这些DE-lncRNA和DE-mRNA的表达变化倍数与测序数据具有良好的相关性。鉴于lncRNA可以通过反式或顺式作用调控靶基因，作者推测这些差异表达的lncRNA及其靶标mRNA，可能在小麦中Gc作用的不同功能中发挥重要作用。

图2. CS和CS-3C中lncRNA和mRNA的差异表达分析

为了探究DE-lncRNA和DE-mRNA在染色体位置上的偏好性，作者后续将这些DE-lncRNA和DE-mRNA的位置，精确地比对到了小麦的各个染色体上。结果显示，DE-lncRNA和DE-mRNA在小麦的21条染色体中呈现出不均匀的分布模式。作者发现，第三同源群染色体上分布的DE-lncRNA和DE-mRNA数量最多(图3)。此外，与A、B亚基因组中对应的染色体相比,小麦D基因组染色体上的DE-lncRNA和DE-mRNA数量总体偏少。

图3. DE-lncRNA和DE-mRNA在染色体范围内的分布

3. DE-lncRNA的靶标DE-mRNA分析

基于lncRNA和mRNA在基因组中的位置关系，作者希望能够预测差异表达lncRNA(DE-lncRNA)的靶标差异表达mRNA(DE-mRNA)。作者将位于靶标DE-mRNA上游10kb或下游20kb区域内的DE-lncRNA视为顺式作用元件(cis-acting elements)，而其他lncRNA则被认定为反式作用元件(trans-acting elements)。

研究结果显示，共有161个DE-mRNA被预测为145个DE-lncRNA的靶标，其中104个靶标mRNA是通过顺式调控(cis-regulation)受到lncRNA的调控,60个靶标mRNA则是通过反式调控(trans-regulation)受lncRNA调控。此外,还有3个靶标mRNA同时受到顺式和反式调控。

图4. CS和CS-3C中DE-lncRNAs和DE-mrnAa之间的顺式和反式调节功能网络

在145个DE-lncRNA中，有79个上调并靶向95个DE-mRNA，其中81个mRNA为上调，14个为下调。在79个上调lncRNA中，25个位于24个mRNA上游10kb内，8个与7个mRNA重叠，25个位于24个mRNA下游20kb内，32个则作为反式作用元件。

另有66个下调lncRNA靶向69个DE-mRNA，其中16个为上调，53个为下调。在这66个下调lncRNA中，16个位于19个mRNA上游10kb内，6个与6个mRNA重叠，27个位于28个mRNA下游20kb内，20个为反式作用元件。

通过分析lncRNA与mRNA的基因组位置关系，揭示了lncRNA在基因表达调控中的作用类型,并探索了它们的表达模式和共表达关系。这些发现为深入理解lncRNA的功能机制提供了重要的线索。

4. lncRNA-mRNA的功能验证

为了确定这些DE-lncRNA在调控靶标mRNA方面的潜在功能，作者使用了在线工具LncTar来预测L006278(在CS-3C中上调)和MTCONS_00006277(简称为M006277，编码CBL互作蛋白激酶19类似物)的最小自由能联合结构。

首先,通过在线工具LncTar预测，L006278可以基于碱基配对靶向M006277。烟草瞬时转化系统实验显示，L006278能显著降低M006277-GUS融合蛋白的GUS活性，表明L006278抑制了M006277的表达。后续对M006277进行碱基突变(mM006277)以破坏其与L006278的配对后，L006278对mM006277的抑制作用减弱，进一步证实了L006278与M006277的特异性相互作用。除此之外，qRT-PCR结果显示，L006278对M006277转录积累具有抑制作用。

图5. 通过在烟草中的瞬时表达试验验证L006278对M0006277的结合和调控

然后，作者构建了由玉米Zm13花粉特异性启动子控制的L006278过表达载体,并通过水稻遗传转化研究了L006278对花粉育性的影响。转基因水稻品系中L006278表达水平显著升高，同时水稻中M006277的同源基因LOC_Os05g43840的表达水平显著下调。表型分析结果显示，L006278的过表达显著降低了水稻的育性，包括结实率。花粉萌发实验和I2-KI溶液染色实验表明，转基因水稻的花粉育性显著降低。

图6. 过表达L006278导致转基因水稻的生育性降低

综上所述，该研究证明了L006278作为一种lncRNA，通过与靶标mRNA M006277的特异性相互作用,抑制其转录积累,并进而影响植物的雄性育性(图6)。

5. DE-lncRNA作为相互竞争的内源性RNA

先前的报道表明，lncRNA可以作为miRNA的内源靶标模拟物(eTMs)，参与花药发育的调控。为进一步探索这一机制，作者通过小RNA测序数据鉴定出241个差异表达的lncRNA(DE-lncRNAs)，这些lncRNA可能作为84个差异表达的miRNA(包括12个新型miRNA)的潜在eTMs，而这些差异表达的miRNA又能靶向315个差异表达的mRNA(DE-mRNAs)。其中，一些DE-lncRNA已被报道作为调控植物雄性育性的保守miRNA家族的eTMs，如miR1120、miR156等。

图7. CS和CS-3C中DE-miRNAs靶向的DE-lncRNAs和DE-mRNAs

此外,作者还鉴定出几个lncRNA-新型miRNA-mRNA的调控网络，这些新型DE-miRNA的靶标mRNAs涉及多种生物过程，包括花粉产生、重组修复等。对这些DE-mRNAs进行GO分析发现，一些与基因沉默、DNA复制以及基因组稳定性相关的生物过程在GO类别中显著富集(图7)。

进一步的研究表明，四个DE-lncRNA可能作为tae-miR9657b-3p的eTMs，其中L117735通过烟草瞬时转化系统被证实可作为tae-miR9657b-3p的eTM，进而减弱其对靶标mRNA的降解作用。同样，L056972也被证实可作为新型miRNA gc-m2240-5p的eTM，减轻其对靶标mRNA的降解作用。这些发现为深入理解lncRNA在植物花药发育中的功能提供了新的视角,并为未来作物改良提供了潜在的靶点。

总结与讨论

(1)本研究进一步揭示，lncRNA不仅通过调控靶标mRNA的表达，还可以作为miRNA的内源靶标模拟物(eTMs)参与Gc过程，从而影响花粉育性。

(2)本研究表明，lncRNA-mRNA网络可能在小麦的Gc作用中发挥重要作用。特定的lncRNA通过调节靶mRNA的表达来影响花粉育性。部分lncRNA与靶标mRNA呈共表达关系，而另一些则呈负相关关系。总的来说lncRNA可以通过调节靶标mRNA参与Gc作用，进而影响离子交换、转运和稳态，为lncRNA与花粉育性之间的联系提供了初步证据。

(3)本研究还构建了lncRNA-miRNA-mRNA网络，并分析了它们在春化作用期间的相互作用。研究发现，特定lncRNA作为miRNA的eTM，能够阻碍miRNA对靶标mRNA的切割，从而调控关键基因的表达，进而影响花粉发育。研究结果表明，lncRNA-miRNA-mRNA网络以及siRNA定向的DNA甲基化共同参与春化作用中的“致死”与“保护”功能，但其精确的调控机制仍需进一步实验验证。

综上所述，本研究通过RNA测序和功能分析,鉴定了小麦中参与配子体致死(Gc)作用的关键lncRNA,发现它们通过调控mRNA表达或作为miRNA的内源性靶标模拟物发挥功能,影响DNA代谢、细胞分裂等生物学过程,进而调控花粉育性。实验验证了lncRNA的功能，并为挖掘花粉育性相关调控基因提供了资源和指导，对杂种优势利用具有重要意义。

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzk0NTIxODcxMQ==&mid=2247503987&idx=2&sn=15707af199cc5ce0e8b38b37d21dca9f

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