一、研究背景
人表皮生长因子受体 2 （HER2） 的过表达定义了具有侵袭行为的乳腺肿瘤亚组。曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗是化疗和抗 HER2 单克隆抗体的组合，是原发性 HER2 阳性乳腺癌患者的主要新辅助治疗。对新辅助治疗的病理完全缓解 （pCR） 的实现与无病生存期和总生存期的改善有关。然而，35-50% 的患者没有达到 pCR 和/或最终复发 。促成抗 HER2 抗体疗效的机制之一是触发自然杀伤 （NK） 细胞介导的抗体依赖性细胞毒性 （ADCC）。
NK 细胞是细胞毒性的先天淋巴细胞，可以直接消除癌细胞。当与表达 HER2 的靶标结合时，IgG1 亚型的抗 HER2 抗体可通过 FcγRIIIa （CD16） 触发 NK 细胞活化，导致细胞毒性颗粒释放到靶细胞，并分泌 IFNγ、TNFα 和 T 细胞募集趋化因子。这些作用机制导致肿瘤细胞裂解，并可能有助于随后抗肿瘤适应性免疫反应的发展。我们最近证明，诊断性活检中肿瘤浸润 NK 细胞 （TI-NK） 的数量与抗 HER2 抗体新辅助治疗后 pCR 的实现和无病生存期延长相关，与常规临床病理因素无关。尽管显示出作为反应预测因子的显着潜力，但肿瘤活检中 TI-NK 细胞的数量很少，这表明 TI-NK 细胞除了具有细胞毒功能外，还作为肿瘤微环境的调节剂具有推定的作用。
NK 细胞属于先天淋巴细胞家族 （ILC），该家族还包括具有调节功能的组织驻留非细胞毒性淋巴细胞亚群。然而，NK 细胞似乎是含量最高的 ILC，非细胞毒性 ILC1 以及 ILC3 细胞在人和小鼠乳腺肿瘤中也有报道。虽然在许多肿瘤类型中观察到 NK 细胞浸润与预后改善之间的关联 ，但非细胞毒性 ILC 对抗肿瘤免疫的贡献仍然存在争议，在环境和模型依赖性方式下显示出促肿瘤和抗肿瘤作用。此外，由于肿瘤微环境的影响，肿瘤浸润性 NK 细胞发生表型和功能改变，增加了每个特定 ILC 亚群的描绘难度 。
CCL5 与可诱导的 CXCL9 和 CXCL10 趋化因子之间的合作指导 CXCR3 NK 和 T 细胞浸润到实体瘤中，并与免疫检查点阻滞剂对化疗和免疫治疗的有利反应相关，但这些机制如何协调以响应基于抗 HER2 抗体的治疗仍未解决。
二、研究结果
Result 1 CCL5/IFNG-CXCL9/CXCL10 轴将 TI-NK 细胞与基于新辅助抗 HER2 抗体的治疗的有效性联系起来
在未经治疗的乳腺肿瘤活检中，肿瘤浸润NK细胞（TI-NK细胞）的存在/缺失与HER2+乳腺癌原发疾病患者对基于抗HER2抗体的新辅助治疗的获益/抵抗有关[7]。为了全面了解与 NK 细胞浸润相关的生物学过程，我们通过芯片分析比较了富含 NK 细胞（n = 6）与缺乏 NK 细胞（n = 6）的 HER2+ 肿瘤诊断活检组织的转录组。纳入的活检组织在TI-NK细胞含量和抗HER2抗体治疗反应方面不一致，但在患者年龄、肿瘤面积和TIL评分方面匹配（图1A、B）。富含TI-NK细胞的肿瘤与缺乏TI-NK细胞的肿瘤相比，有130个差异表达基因（DEG），包括42个下调基因和88个上调基因（补充图1B）。DEGs的典型通路分析（Canonical Pathway Analysis）发现，在NK细胞浸润的乳腺肿瘤中，GP6、PKCθ、TLR、NF-ƙB信号转导和树突状细胞成熟等生物过程的基因富集，IL-6信号转导相关基因的得分也呈负值（图1C）。基因调控网络的分析表明，IFN-γ、TNF 和 I 型 IFNs 是 DEG 的主要调控因子，它们在富含 TI-NK 细胞的肿瘤中汇聚成 CXCL9 和 CXCL10 的协调上调（补充图 1C 和图 1D）。事实上，CCL5、IFNG、CXCL9 和 CXCL10 的表达彼此正相关，也与原始活检中肿瘤浸润 NK 细胞的数量正相关（图 1E-F）。在一项 II 期随机试验（GSE130786，n = 81）中生成的 HER2 阳性乳腺肿瘤基因表达公开数据集中对这 4 个基因的分析证实了我们最初的发现。此外，在这个更大的数据集中，基线活检中 CCL5、IFNG、CXCL9 和 CXCL10 的转录水平相互正相关（图 1G）。在多变量逻辑回归分析中，IFNG的相对表达与TI-NK细胞基因特征（图1H）和基于曲妥珠单抗的新辅助治疗达到pCR的概率（OR 96.3，p = 0.01）（图1I）呈正相关。这些结果表明，NK细胞是IFN-ɣ的原始来源，并表明CCL5/IFNG-CXCL9/10轴对基于抗HER2抗体的原发性HER2 +乳腺癌患者临床疗效的重要性。
Result 2 抗 HER2 抗体依赖性 NK 细胞活化过程中产生的 IFN-ɣ 触发乳腺癌细胞产生 CXCL9/10
我们接下来研究了曲妥珠单抗依赖性 NK 细胞活化过程中产生的细胞因子是否会在体外共培养试验中刺激旁观者乳腺癌细胞产生 CXCL9/10。根据无细胞共培养上清液中的 ELISA 分析，曲妥珠单抗诱导的 NK 细胞对 SKBR3、BT474 和 HC1954 HER2 阳性乳腺癌细胞的活化会导致 CCL5、IFN-γ 的分泌以及随之而来的 CXCL9 和 CXCL10 的产生（图 2A）。包括 I 型 IFNs（抗 IFNAR）的阻断抗体或 IFN-γ 和 TNF-α 的中和抗体在内的检测表明，HCC1954 细胞的 CXCL9 分泌主要由 IFN-γ 驱动，而 I 型和 II 型 IFNs 都有助于 CXCL10 的产生（图 2B）。SKBR3 细胞系也得到了类似的结果（补充图 2）。当然，用重组细胞因子体外处理 HCC1954 和 SKBR3 细胞证实了 IFN-γ 在调节 CXCL9 和 CXCL10 分泌中的主要作用。此外，它还揭示了 IFN-γ 和 TNF-α 在诱导乳腺癌细胞产生 CCL5 和 CXCL9 方面的合作效应（图 2C）。值得注意的是，IFN-β的作用是趋化因子依赖性的，显示出适度的诱导CXCL10的能力，这是与IFN-γ和TNF-α诱导CCL5分泌的合作效应，同时抵消了IFN-γ和TNF-α对CXCL9分泌的影响（图2C）。正如体外实验中曲妥珠单抗依赖性 NK 细胞活化所检测到的，不同乳腺癌细胞系对 IFN-γ 的反应所释放的趋化因子水平差异很大（图 2A 和 C）。这些结果表明，NK 细胞与乳腺癌细胞的相互作用以及抗 HER2 抗体依赖性 ADCC 足以释放 CCL5/IFN-ɣ-CXCL9/10 轴的分泌。
Result 3 抗HER2抗体激活CD16+ NK细胞与肿瘤生长控制、IFN-ɣ产生和CD103表达的获得有关
为了探讨抗HER2抗体的全身治疗是否真的会导致TI-NK细胞的活化和CCL5/IFN-γ -CXCL9/10轴的触发，我们建立了一个人源化体内模型。将HCC1954异种移植物皮下植入NOD/Scid/γc-/-（NSG）小鼠体内，然后用以下两种方法之一进行治疗： i）腹腔注射抗 HER2 抗体（曲妥珠单抗和培妥珠单抗）；ii）腹腔注射对照组 hIgG1（利妥昔单抗）；iii）瘤内注射扩增的人 NK 细胞，同时腹腔注射对照组抗体；或 iv）腹腔注射抗 HER2 抗体和瘤内注射扩增的人 NK 细胞（图 3A）。3A). 与对照组相比，接受人 NK 细胞和抗 HER2 抗体联合治疗的小鼠完全抑制了肿瘤的生长，其疗效超过了曲妥珠单抗/pertuzumab 双联治疗或 NK 细胞单药治疗（图 3B）。治疗结束后，切除剩余肿瘤并获取总 RNA。在接受 NK 细胞治疗的肿瘤中只检测到 IFNG 转录物（图 3C）。与未接受治疗的肿瘤相比，接受全身抗 HER2 抗体或瘤内 NK 细胞单药治疗的动物的肿瘤显示 CCL5 和 CXCL10 的表达增加，但 CXCL9 转录物的表达没有增加。只有在 NK 细胞和抗 HER2 抗体联合治疗的肿瘤中才能检测到 CCL5/IFNG-CXCL9/10 水平的协调增加，这支持了有效触发 CCL5/IFN-γ -CXCL9/10 轴需要这两种元素（图 3C）。从切除的肿瘤中提取的肿瘤浸润 NK 细胞的表型特征显示，与注射前的 NK 细胞产物（CD16+CD103- NK 细胞）相比，瘤内 NK 细胞在 CD16 丢失（CD16-CD103+ NK 细胞）的同时逐渐获得了 CD103（CD16+CD103+）（图 3D）。这种效应与激活刺激的程度和肿瘤生长的控制成正比（图 3D，B）。总之，这些结果表明，CD16+ NK 细胞在抗 HER2 抗体存在的情况下对抑制肿瘤进展起着直接作用。值得注意的是，这种作用与 CCL5/IFNG-CXCL9/10 轴的触发及其表型的变化有关，让人联想到上皮内 ILC1。
Result 4 与人乳腺肿瘤中不同的免疫结构相关的特殊肿瘤浸润 NK 细胞亚群
根据体内模型的观察结果，我们通过流式细胞术分析了来自新鲜、未经治疗的人类乳腺肿瘤标本的肿瘤浸润 NK 细胞中 CD16 和 CD103 的表达情况。CD16 和 CD103 的差异表达区分了传统 NK 细胞门（CD56+ CD3- 淋巴细胞）中的三个亚群： CD16+细胞与CD103的不同表达、CD16-CD103+和CD16-CD103-亚群（图4A）。用抗 HER2 抗体体外处理人乳腺肿瘤衍生多细胞培养物时，CD16+ NK 细胞的活化呈剂量依赖性，CD137 的上调证明了这一点（图 4B、C）。在一些培养物中，CD16- CD103+ 和 CD16-CD103- TI-NK 细胞亚群在曲妥珠单抗处理后也检测到了 CD137 的上调（图 4C）。
然后，我们试图在一组前瞻性招募的新鲜乳腺肿瘤标本（n = 84；队列描述见补充表 1）中描述不同 TI-NK 细胞亚群与主要 T 细胞亚群之间的关系。采用多参数流式细胞术分析 TIL 含量，使用一组抗体来区分存活的白细胞（CD45+ DAPI-），CD3 和 CD56 用于 T/NK 细胞门控，CD4 和 CD8、CD103 和 PD1 分别用于分析组织驻留淋巴细胞和衰竭淋巴细胞，此外还有 NK 细胞活化受体 CD16 和 NKG2C。初步分析包括通过多维 v-SNE 对存活的 TIL 进行无偏聚类，利用的数据来自 18 个随机选取的肿瘤（5 个 HER2 阳性、11 个 Luminal 和 2 个 TNBC）。Phenograph 聚类和人工分组确定了 10 个主要的淋巴细胞亚群（补充图 3A、B）。除了传统 NK 细胞门（CD56+ CD3- 淋巴细胞）中已定义的三个 NK 细胞亚群外，伴随的免疫浸润还包括 CD8 和 CD4 T 细胞群，并进一步细分为 CD103+PD1+、CD103-PD1+ 和 CD103-PD1- 细胞。此外，还发现了一部分所有标记均为阴性的淋巴细胞，并将其解释为 B 细胞集群（图 4D，补充图 3A、B）。我们从所有肿瘤中收集了这些 NK 和 T 细胞亚群的数据，并进一步分析了它们之间的相关性。在大多数样本中，虽然也检测到不同比例的 CD103+CD16- 和 CD16- CD103- 细胞，但在 TI-NK 细胞中，CD16+ 亚群占主导地位（图 4E）。CD16+以及CD16+和CD16-CD103+亚群的比例与乳腺肿瘤浸润中TI-NK细胞的总体比例呈正相关（图4F），间接支持了CD16+和CD16-CD103+ NK细胞的存在与基于抗HER2抗体的新辅助治疗效果之间的关联。值得注意的是，CD16+ 和 CD103+ TI-NK 细胞与 CD4+ T 细胞总数呈负相关，而与 CD8 和组织驻留 CD103+ CD8+ T 细胞总数呈正相关。这两种淋巴细胞亚群都与乳腺癌预后的改善有关。CD16- CD103+ TI-NK 细胞与 CD3+ CD103+ T 细胞（包括 CD8+ CD103+ 和 CD4+ CD103+ T 细胞）之间的正相关性最强（图 4F）。这些发现表明，特定的肿瘤微环境同时在先天性淋巴细胞和适应性淋巴细胞中植入了组织驻留程序。另一方面，CD16-CD103- TI-NK 细胞与 TI-NK 细胞总数呈负相关，并与以 CD8+ 和组织驻留 CD103+ T 细胞比例下降以及 CD4 T 细胞频率升高为特征的免疫浸润相关（图 4F），支持它们与更具调节性的免疫环境相关。对 HER2 阳性肿瘤队列（n = 20）的特别分析显示了淋巴细胞亚群之间的类似关系（图 4G）。事实上，淋巴细胞亚群的分布在所有乳腺肿瘤分子亚型中都具有可比性（补充图 4）。
总之，CD16+ 和 CD16-CD103+ TI-NK 细胞亚群与体内模型中控制肿瘤生长的 TI-NK 细胞相似，与富含组织驻留记忆 T 细胞的免疫浸润相关。相反，CD16-CD103- TI-NK 细胞亚群可能含有 ILC3 细胞，与高 CD4/CD8 T 细胞比率的免疫浸润相关。
Result 5 在人乳腺肿瘤中，CD16 和 CD103 识别能够产生 CCL5 和 IFN-ɣ 的谱系相关 NK 细胞亚群
接下来，我们对三个乳腺肿瘤样本中的 CD16+、CD16-CD103+ 和 CD16-CD103- NK 细胞进行了分选和亚群批量 RNA-seq 分析。为了进行比较，根据配对外周血样本中 CD56 和 CD16 的表达对 CD56dim 和 CD56bright 循环 NK 细胞进行了分选（图 5A 和补充图 5A）。三个 TI-NK 细胞亚群的转录组非常相似（补充图 5B）。CD16+、CD16-CD103-和CD16-CD103+ TI-NK细胞分别有23个、51个和68个转录本。
CD16+ TI-NK 细胞中上调的转录本与几种重要的 NK 细胞分子相对应，包括细胞系转录因子（即 ZEB2、EOMES 和 NK2）。ZEB2、EOMES 和 TBET (TBX21)）、细胞毒性效应因子（GZMB、PRF1、FASL、TNFSF10）、KIR 受体（KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL1、KIR2DL3）和趋化因子/细胞因子受体（即 CXCR1）（图 5B）。CD16-CD103+ TI-NK 细胞与 CD16+ TI-NK 细胞一样表达 EOMES 和抑制性 KIR 的转录本，但却表现出组织驻留特征，转录因子 HOBIT（ZNF683）和组织/肿瘤保留分子如 CD9 和 CD151（除 CD103 外）的表达量最高，让人联想到 TGFβ 诱导的 ILC1，类似于组织驻留记忆 T 细胞[24]（图 5B）。值得注意的是，CD16-CD103+ TI-NK 细胞的独特特征包括除了最高水平的 IFNG 转录本外，还富含编码参与免疫/树突状细胞招募的趋化因子（CCL5、XCL1 和 XCL2）[5]的转录本（图 5B）。最后，CD16-CD103-TI-NK 细胞显示了 IL7R、IL23R、IL2RA、CCR7 和 CCR8 的高表达，以及 LEF1、CSF2、CCL22 和 TNFSF13B 转录本的高表达，表明其中含有 ILC3 细胞（图 5B）。事实上，对照先前描述的循环和扁桃体 NK、ILC1 和 ILC3 细胞特征[25]，对不同的 TI-NK 细胞转录组进行的 GSEA 分析进一步证实了 CD16+ TI-NK 细胞与循环 CD56dim NK 细胞、CD16- CD103+ TI-NK 细胞与扁桃体 ILC1 之间的相似性，而 CD16- CD103- TI-NK 细胞亚群与免疫调节 ILC3 相似（图 5C）。
总之，这些数据支持人乳腺肿瘤中肿瘤浸润CD16+和CD16- CD103+ NK细胞之间的系谱关系，这两个亚群都能产生CCL5/IFN-ɣ。此外，它还证明了 CD16- CD103- 亚群的调控特征，让人联想到调控 ILC3。
Result 6 血清 CCL5/CXCL9 的早期升高可识别 NK 细胞丰富的肿瘤患者，并且对基于抗 HER2 抗体的新辅助治疗反应良好
接下来，我们研究了是否能在全身水平检测到与 TI-NK 细胞活化相关的细胞因子和趋化因子。我们从接受了基于 HER2 抗体的新辅助治疗的 HER2 阳性乳腺癌原发患者中收集了前瞻性纵向血清样本。样本在基线（n = 79）和三个化疗周期（n = 32）后采集（队列描述见补充表 2）。44例纳入患者的基线TIL评分和相应诊断活检中的TI-NK细胞数量均可获得[7]（图6A）。初步检测显示，未检测到 IFN-γ，而在独立的 ELISA 检测中，血清样本中 CCL5、CXCL9 和 CXCL10 的检测结果具有很高的重现性（补充图 6A）。与肿瘤基因表达不同的是，无论患者对基于抗 HER2 抗体的新辅助治疗反应如何，基线血清样本中的全身 CCL5、CXCL9 和 CXCL10 水平在所有患者中都相似（补充图 6B）。然而，在对治疗有良好反应的患者（G5 和 G4）中，经过三个化疗周期后，发现全身 CCL5 和 CXCL9 水平协调增加（图 6B）。对于有可用数据的患者，在获得 pCR（G5）的患者中，基线活检中的 TI-NK 细胞数量更高（图 6C），并且与新辅助化疗后的全身 CCL5 和 CXCL9 水平呈正相关（图 6D），间接支持了 TI-NK 细胞在促进 CCL5/IFNɣ 依赖性免疫反应微环境中的贡献。
三、总结与思考
这项研究表明，浸润肿瘤的自然杀伤细胞 （TI-NK） 在激活时产生 CCL5 和 IFN-ɣ，从而触发有效的抗肿瘤免疫反应以及基于抗 HER2 抗体的新辅助治疗的发展。我们的观察结果表明，抗肿瘤免疫是患有 NK 细胞丰富肿瘤的原发性 HER2 阳性乳腺癌患者抗 HER2 抗体的主要作用机制，并为在这些患者中研究免疫疗法的组合方法提供了理论依据。此外，我们的研究支持 TI-NK 细胞或 TI-NK 细胞替代物作为优化患者分层和个性化临床管理的生物标志物的潜力。
图片 / 网络（侵删）
策划 / 殷佩浩
审校 / 殷佩浩
翻译 / 汪玉倩
责任编辑 /汪玉倩
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