近日，瑞士联邦水环境科学与技术研究所（Eawag）Elisabeth Janssen团队在环境领域著名学术期刊Environmental Science & Technology上发表了题为“Tracking Extensive Portfolio of Cyanotoxins in Five-Year Lake Survey and Identifying Indicator Metabolites of Cyanobacterial Taxa”的论文。文章追踪监测了瑞士境内一中度富营养化湖泊蓝藻毒素及次级代谢产物5年间浓度（或相对浓度）变化，分析了150采样日期共850样品。此外，通过分析从湖中分离的三株蓝藻的次级代谢产物，识别了爆发藻种的指示代谢物质。研究表明选取高LC-MS响应，高频出现且爆发藻种特异合成的代谢物质，有利于蓝藻爆发的监测。
引言
有害蓝藻爆发在发生频率、爆发范围及持续时间上日益增长，已成为全球性的水环境问题。其中蓝藻毒素的释放尤其对水生态环境及人体健康具有较大危害。目前藻毒素的监测研究往往只关注世卫组织规定的4种藻毒素，尤其是微囊藻毒素Microcystin-LR （MC-LR）。文献报道重点关注爆发水体中蓝藻生物量、MC-LR浓度及MC-LR与环境监测指标例如氮磷含量、叶绿素a浓度的相关关系。然而除了MC-LR，有害蓝藻同时产生及释放多种次级代谢产物包括Anabaenopeptins, Cyanopeptolins和Microginins等。这其中部分物质被报道具有生物活性，例如抑制酶活。然而相关次级代谢物质在蓝藻毒素监测中却少有涉及，长期多次取样研究则更罕见。此外，多数关于蓝藻毒素的研究通常探究藻毒素与其他监测指标例如叶绿素a、氮磷、温度等相关关系，以期以例如叶绿素a含量的变化预测藻毒素含量变化。然而许多蓝藻爆发水体同时存在不产毒素蓝藻及其他藻类，这导致叶绿素a不总能很好反映藻毒素的变化。本研究利用高效液相色谱串联高分辨率质谱（LC-HRMS/MS），通过靶向分析和基于CyanoMetDB数据库的非靶向筛查，对一中度富营养化水体蓝藻毒素及次级代谢物质进行了5年的取样监测。并通过分析从湖中分离的三株蓝藻次级代谢产物，提出了各蓝藻的指示代谢产物。
图文导读
蓝藻毒素及次级代谢产物的多样性
表1：5年湖泊蓝藻毒素和次级代谢物质监测结果。
本研究利用高分辨率质谱，对5年间采样获得的850个样品进行了蓝藻毒素靶向分析和基于CyanoMetDB数据的非靶向筛查。CyanoMetDB是一个收录了超2000种文献报道的蓝藻毒素及次级代谢产物结构的开源数据库。本研究共检出46种蓝藻毒素或代谢物质，其中9种物质经标样确认结构（confidence level 1）。剩余37种物质中，11种列为tentative candidates (confidence level 3: exact mass <5 ppm mass error; accurate isotopic pattern, Skyline idotp value >0.9; and evidence from fragmentation data)，26种列为probable structure （confidence level 2: 包含额外全面的MS2注释，但无标样确认结构）。本研究后续只关注confidence level 2及以上的35种物质，基于化学结构大致可分为Microcystin, Anabaenopeptin和Microginin三类。
靶向蓝藻毒素5年间的浓度变化
图1：[D-Asp3,(E)-Dhb7]MC-RR和Anabaenopeptin A从2019到2023年间在Greifensee湖的浓度变化（单位ng/L），图1上部n代表每年的采样日期数，每个采样日期有3个平行样，黑色数据点代表生物相中的浓度，蓝色数据点代表水相中的浓度，虚线代表定量限（LOQ），年间空白时间未进行采样。
[D-Asp3,(E)-Dhb7]MC-RR是Microcystin标样中检出浓度最高的物质，最高浓度约70 ng/L，每年变化趋势相似，即浓度在夏秋季节达到最大值，5年监测中其浓度远低于WHO规定的MC-LR在娱乐水体中不高于24μg/L的标准。Oscillamide Y是Anabaenopeptin标样中检出浓度最高的物质，约2000 ng/L，比[D-Asp3,(E)-Dhb7]MC-RR高了2个数量级。由于Oscillamide Y标样纯度相对较低，图1展示了Anabaenopeptin A, Anabaenopeptin标样中检出浓度次高的物质，最大检出浓度约90 ng/L。和[D-Asp3,(E)-Dhb7]MC-RR相似，其浓度在夏秋季节达到最大值，但 [D-Asp3,(E)-Dhb7]MC-RR和Anabaenopeptin A的高浓度出现在不同年份。
蓝藻毒素及代谢物质的LC-MS响应强度及检出频率
图2：35种次级代谢物质2019至2023五年间的(a)检出频率(b) LC-MS响应强度（峰面积）；以及(c)三株湖泊分离出的蓝藻对35种次级代谢物质的合成产生能力。
本研究统计了150采样日期中35种代谢物质的检出频率，如图a所示。由于缺少非靶向物质的标样，无法计算出准确浓度，因此本研究关注各物质在LC-MS上的响应强度（即峰面积），峰面积越高的物质越容易进行仪器分析及追踪监测，如图b所示。结合图a和b，可以看出部分物质检出频率高且检出峰面积也高，如Anabaenopeptin F；部分物质具有高检出频率但低峰面积，如Anabaenopeptin D；部分物质检出频率低但检出峰面积高，例如Ferintoic acid B。结合检出频率和LC-MS相应强度（峰面积），可以发现尽管Microcystin较为频繁检出，但Anabaenopeptin和Microginin才是监测湖泊中的主要蓝藻代谢物质。
蓝藻指示代谢物质
图3：4种指示代谢物质5年丰度变化。
本研究首先对蓝藻代谢物质和环境监测指标进行了相关性分析，结果表明代谢物质与单一监测指标并无直接相关关系。在进行湖泊蓝藻毒素及次级代谢物质监测中，3株爆发蓝藻被分离并进行实验室纯培养。经显微镜镜检、PCR和16s RNA分析鉴定，其中两株为Microcystis，一株为Planktothrix。根据分离年份不同，将三株藻命名为Planktothrix G2020，Microcystis G2011以及Microcystis G2020。随后分析了三株蓝藻的代谢物质并与湖泊中检出物质进行比对，结果如图2c所示。研究进一步提出了4种指示代谢物质: [D-Asp3, (E)-Dhb7]MC-RR仅可被Planktothrix G2020合成，Microginin 761B仅可被Microcystis G2011合成，Ferintoic acid B仅可被Microcystis G2020合成，而Oscillamide Y可被任一藻株合成。3种特殊指示代谢物质的丰度变化可能反映合成藻株的生物量变化或代谢产物合成水平变化或二者变化相结合，而Oscillamide Y的丰度变化则反应总体上蓝藻生物量或者代谢物质合成水平变化。
小结
本研究利用高分辨率质谱，通过靶向分析和非靶向筛查，追踪监测了一湖泊46种蓝藻毒素及次级代谢物质5年间浓度（或相对浓度）变化。此外，通过分析从湖中分离的3株蓝藻的次级代谢产物，识别了各藻株的指示代谢物质。研究表明选取高质谱响应，高频出现且爆发藻种特异合成的代谢物质，将有利于蓝藻爆发的监测。
本项目得到了瑞士国家科学基金委(SNF)的资助。
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