近日，厦门大学生命科学学院郭峰副教授课题组在《Nature Communications》期刊上发表了题为“Sequencing-guided re-estimation and promotion of cultivability for environmental bacteria”的研究论文。研究聚焦于环境细菌的低可培养率这一广泛认知的问题。以往对细菌可培养率的估计多是基于可培养细胞的比例，但从微生物资源和多样性角度来看，关注可培养类群占所有类群的比例更加重要。由于培养条件与微生物在自然环境中的生长条件差异较大，目前大多数微生物仍被归类为“不可培养”或“未培养”状态，其中包括一些在高分类阶元（如门、纲等水平）没有代表菌株的“微生物暗物质”。该研究通过结合细胞计数、16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组学以及在琼脂平板上的多种培养条件，重新估算了来自土壤和活性污泥这两类样品的环境细菌可培养率，并将结果与传统的细胞水平可培养率进行了比较，发现过去的可培养率普遍被低估。此外，研究提出将可培养特性视为一种表型，利用测序数据挖掘可培养细菌类群及其基因组的代谢潜力，指导特定微生物的分离和培养。通过这一策略，研究团队成功分离到一株代表Bacteroidota中尚未培养的新纲细菌，并显著提升了活性污泥中Burkholderiales的可培养多样性。这种方法为未来环境微生物的培养和功能研究提供了新的思路与工具，进一步丰富了对环境微生物资源的认知。
研究意义：
“平板计数异常”的现象，指的是在典型环境样品中，显微镜计数的细胞总数往往远远高于通过琼脂平板培养所得的菌落形成单位（CFUs，即可培养细胞数）的结果。这一现象已困扰科学界超过一个世纪，而“仅有1%的微生物可培养”这一观点也已被广泛接受，成为默认的范式。然而，以往关于细菌可培养率的研究大多集中于可培养细胞的比例，而从微生物资源和多样性角度来看，探讨可培养类群占所有类群的比例更为重要。由于实验室培养条件与微生物在自然环境中的生长条件存在显著差异，大多数微生物至今仍被认为是“不可培养”或“未培养”，其中包括高分类阶元（如门、纲等水平）下尚未有可培养代表菌株的“微生物暗物质”。
本研究针对两类典型环境样本（6个土壤样本和5个活性污泥样本）的细菌，采用了简化的培养组学方法，结合不同氧气条件和培养基类型，重新估算了环境细菌的可培养率（即分类单元的可培养率），并将其与传统的细胞水平可培养率进行了对比。研究还提出了将可培养特性视为一种表型，基于测序数据挖掘可培养细菌类群及其基因组代谢潜力，用于指导特定微生物的分离与培养。这一新策略为未来实验室中培养环境微生物提供了一条全新的思路和方法，有望破解长期以来的培养难题，进一步拓展微生物研究的广度与深度。
研究结果：
分类单元可培养率(PCT) 超过细胞水平可培养率 (PCC)
图1：土壤和活性污泥（AS）样品中分类单元可培养率（PCT）和细胞水平可培养率（PCC）计算。
基于传统的显微计数和CFU计数测定细胞水平可培养率；通过测序掌握原始样品和平板培养后的细菌类群信息，从而计算分类单元可培养率（图1a）。PCT在土壤和活性污泥样品中的值显著高于PCC（约为2.8-6.0倍）（图1c），这暗示以往测定的细胞水平可培养率低估了环境细菌的可培养多样性。
影响细菌可培养率的因素
图2：培养基(a)、氧气可用性(b)、接种体中ASVs的相对丰度(c)和系统发育距离(d)对ASVs可培养性的影响。
研究结果显示，更符合细菌的自然生长条件的提取培养基能培养出更多的可培养ASVs（图2a）。虽然优势ASVs（相对丰度>0.1%）的可培养性高于稀有ASVs（≤0.01%），但不同相对丰度的稀有ASVs（0.01-0.1% vs ≤0.01%）组间差异并不明显（图2c）。
大量可培养的分类群是新颖的，但在琼脂平板上以低丰度存在
图3：新颖分类群在培养样品中的分布。
研究结果显示，大部分可培养分类群在分类上是新颖的（图3a-b）。它们在琼脂平板上以非常低的丰度存在，形成微菌落（图3c-f），但它们继代培养的成功率显著低于大菌落（图3g）。
测序指导下分离的菌株代表一个新纲
图4：菌株EBPR01的分离与描述。
在反应器活性污泥培养样品的扩增子数据中鉴定出一个具有高度新颖性的ASV（相似度低于90%）（仅在原位培养基和厌氧条件中检出，且相对丰度>5%）。在对应宏基因组数据中获得一个被注释为c_JABWAT01纲的MAGs（不含16S rRNA基因）（图3b，4a）。以此信息为指导，研究者获得了一株与上述高新颖度ASV具有相同16S rRNA基因序列的分离菌株（命名为EBPR01）（图4b）。经过基因组学分析确认其隶属于拟杆菌门下一个此前未培养的纲c_JABWAT01（图4c）。
泛代谢活性与可培养性有关
图5：通过培养实验确定的可培养和不可培养ASVs的代谢活性。
(原始状态：O、原位培养基中未处理的生物絮凝体：UI、R2A培养液中未处理的生物絮凝体：UR、原位培养基中分散的细胞：DI、R2A培养液中分散的细胞：DR)
为了了解实验室处理后活性污泥细菌的代谢活性和短期适应性是否与ASVs的可培养性存在关联，作者设计了一个短期暴露实验（图5a）。实验结果显示，可培养 ASVs 在所有实验条件下的代谢活性显著高于不可培养 ASVs（图5b）。与不可培养的ASVs 相比，可培养的ASVs 对实验室处理的适应性更强，但分散处理对它们的代谢差异不大（图5c），且在原位水条件表现为代谢均大幅下降。
比较基因组分析结果提高了Burkholderiales细菌的可培养多样性
图6：通过将可培养/不可培养表型与基因组特征联系起来，提高了活性污泥（AS）样品中的Burkholderiales的可培养多样性。
综上所述，本研究提出了一种基于测序技术的新策略，重新评估并提升环境细菌的可培养率。通过将先进的测序技术与传统的培养手段有机结合，研究揭示了可能帮助“微生物暗物质”显现的关键线索，有望进一步缩小自然界中微生物多样性与实验室中可培养微生物多样性之间的差距。该方法不仅提升了我们培养更多微生物的能力，还为生物修复、生物技术和医学等领域带来了新的发现与应用潜力，开启了更多未来研究的可能性。
第一作者简介：
郑敏佳：厦门大学生命科学学院2020级在读博士研究生。研究方向：自然与人工环境体系中具有重要功能的复杂微生物群落的相互关系研究；尚不可培养微生物类群的富集、培养与分离；强化生物除磷体系活性污泥中聚磷菌的系统发育和生理特性研究。在Nature Communications、Applied Microbiology and Biotechnology等国际著名期刊上以第一作者发表相关学术成果。
温林冉：厦门大学生命科学学院2021届硕士研究生。主要从事自然环境样本中尚不可培养微生物类群的培养与分离。
何彩玲：厦门大学生命科学学院2022级在读硕士研究生。研究方向：环境微生物可培养属性基因组特征的联系。
通讯作者简介：
郭峰：厦门大学生命科学学院副教授，博士生导师。主要从事自然与人工环境中具有重要功能的复杂微生物群落的相互关系研究。重点研究微生物-微生物，微生物-宿主关系及其相关的生理生态和进化过程。从改进培养方法和掌握代谢特征的角度，尝试培养和分离具有重要功能和应用价值的尚不可培养微生物类群。在国内外相关领域的高水平期刊Nature Communications、Microbiome、Water Research、Bioresource Technology等国际著名期刊上以第一/通讯作者发表多篇SCI论文。主持及参与多项国家级及省部级项目。
文章链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-53446-4
