Science：DdmDE防御系统介导的质粒消除的分子机制

文摘 2024-10-29 09:02 瑞士

原文献信息：Loeff, L.; Adams, D. W.; Chanez, C.; Stutzmann, S.; Righi, L. et al. Molecular mechanism of plasmid elimination by the ddmde defense system. Science 2024, 385(6705), 188-194.

摘要：

第七次大流行的霍乱弧菌菌株含有两个致病岛，编码DNA防御模块DdmABC和DdmDE。本研究利用冷冻电子显微镜解析了DdmDE防御质粒的机制。解旋酶-核酸内切酶DdmD呈现自我抑制的二聚体结构。原核Argonaute蛋白DdmE使用DNA引导靶向质粒DNA。通过体内突变实验验证的DdmDE复合体结构表明，DdmE结合DNA会触发DdmD二聚体解离，并将单体DdmD加载到非靶向的DNA链上。体外研究表明，DdmD以5′-3′方向转位，同时部分降解质粒DNA。该研究为DdmDE系统在质粒消除中的机制提供了关键见解。

研究结果：

DdmE是DNA引导的DNA靶向Argonaute蛋白。系统发育分析显示其属于长A型pAgo蛋白的一个亚分支，且缺乏核酸内切酶活性。DdmE在溶液中为单体，通过引导依赖的靶核酸结合生成D环结构，促进DdmD募集。DdmE利用加载5′磷酸化DNA引导靶向dsDNA并招募DdmD，最佳引导长度在12至14 nt范围内。DdmE在催化上无活性，使用短5′磷酸化DNA作为tDNA结合的引导。

质粒消除需要DdmD的ATP酶和核酸酶活性。DdmD含SF2解旋酶和PD-(D/E)XK核酸酶域，对DdmE招募激活下质粒DNA降解至关重要。DdmD突变导致质粒消除能力消失，体外实验显示DdmD需DdmE激活靶向，ATP酶和核酸酶活性促进质粒降解。

DdmD通过二聚体形成自我抑制。DdmD为C2同二聚体，其单体通过静电界面二聚，N端解旋酶域与E. coli DinG相似，二聚界面封闭DNA结合通道，阻止ATP驱动的DNA转位，表明DdmD在二聚体时自我抑制。C端为PD-(D/E)XK核酸酶，催化活性对DdmDE系统消除质粒至关重要。

DNA 引导的 tDNA 识别及 DdmE 对 DdmD 的募集。DdmE与DdmD形成1:1异二聚体，DdmE结合gDNA-tDNA双链，DdmD结合被置换的ntDNA链。DdmE含保守结构域但缺PAZ域，有特有ESD域。gDNA 5′端被MID域束缚，长度超14 nt影响靶标结合。DdmE与tDNA通过多种方式相互作用，ESD域探测双链结构并介导DdmD募集。DdmD的HD2域与DdmE的INS和ESD域间相互作用，关键残基突变影响质粒抗性活性。

DdmE 介导 DdmD 装载至 ntDNA 链。DdmE引导DdmD结合被置换的ntDNA链，形成D环。DdmD通过HD2和HD1结构域与ntDNA连续堆叠，3′末端被Tyr194DdmD稳定。DdmD是5′-3′方向性的DNA解旋酶，通过DNA解链实验得到验证。DdmE招募DdmD至ntDNA链，激活其转位。

文中图表：

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzk0ODU0MTMwOA==&mid=2247490261&idx=1&sn=ad49791d3acfe6db877b0d0019ee94a3

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