mRNA疫苗设计：最优化佐剂性能及递送
健康
2024-09-30 08:12
湖北
摘要：佐剂及递送是mRNA疫苗设计的关键。在现代mRNA疫苗中，佐剂与mRNA疫苗的纳米颗粒中共同递送抗原mRNA，并佐助形成统一的，多合一的制剂。在这类制剂中，许多mRNA疫苗利用mRNA组分疫苗载体组分（脂质和聚合物）的免疫刺激性作为佐剂。然而，mRNA疫苗设计必需仔细认真，过度的佐助和错误的先天免疫信号激活可能会影响疫苗功效并引起不良效果。mRNA疫苗还需要递送系统才能在淋巴器官内实现抗原呈递细胞（APC）中的抗原表达。一些疫苗直接靶向淋巴器官中的抗原呈递细胞，其他则依赖接种疫苗后抗原呈递细胞迁移到引流淋巴结。这篇综述探讨了目前对这些过程的机理理解，以及正在努力基于这些认知提高疫苗的安全性和有效性。mRNA为疫苗提供了有效的工具[1]。在以下这些传染病中，只要递送平台搭建完成，疫苗只需改变 mRNA 序列即实现靶向不同的病原体。这些特点使两款mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273，在冠状病毒19 （COVID-19）引起的严重急性呼吸系统综合症2 （SARS-CoV-2）爆发后一年内，被快速紧急批准。这类疫苗已经证明在各种形式的疫苗中表现出高效性，在控制疫情方面发挥至关重要的作用。mRNA 疫苗诱导产生的中和抗体能高效预防SARS-CoV-2感染。此外，mRNA疫苗可引起细胞免疫反应，其比体液免疫反应更持久，对病毒突变的抵抗力更强[5,6]。细胞免疫在预防COVID-19的严重症状和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL），使其成为癌症疫苗重要候选[7]。mRNA癌症疫苗通过靶向共同的肿瘤相关抗原[8]和来自每个患者基因突变的新抗原[9]，在临床试验中表现出积极的结果。新抗原疫苗的制备需要在鉴定癌症中的基因突变并预测合适的表位后进行快速适配。在这方面，mRNA疫苗可以简单地通过更改对应突变蛋白的mRNA序列来快速制备。从安全角度，mRNA在注射后一周内被快速降解，在体内持续的风险极小[10,11]。最近在人体样本的研究，发现疫苗接种一个月内qPCR几乎检测不到mRNA[12]。在传染病中每年数十亿剂量的规模也是另一个关键属性[13]。早在十九世纪九十年代中期有文件记载了针对传染病和癌症的mRNA疫苗[14,15]。但是，它们需要多年的研究和技术突破，才能取得当前的临床成功，尤其是在mRNA合成和递送系统方面。在前者中， mRNA的假尿苷修饰可缓解针对mRNA的先天免疫反应并提高蛋白质翻译效率[16]。其他关键技术包括添加5'加帽和多聚腺苷酸尾巴、编码区和非翻译区域的序列优化，以及从体外转录的mRNA中去除杂质，在其他地方有广泛的综述[17,18]。这些mRNA合成技术通过避免不良炎症反应提高mRNA疫苗的安全性，并通过提高抗原生产效率来提高疫苗功效。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APC和淋巴组织中，并促进细胞内的mRNA运输至细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究揭示了递送纳米颗粒作为免疫刺激佐剂的作用[19,20]。值得注意的是，在二十世纪一零年代中期前，大多数mRNA疫苗临床试验采用体外mRNA递送后的APC移植[21]。但是，离体策略要求移植前细胞培养达到临床等级十分艰难，从而限制了癌症免疫疗法中mRNA的应用。最近的技术进步保证了体内mRNA递送的有效性，拓展了传染病疫苗中mRNA的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的离体手术。在上述mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述着重于两个问题：针对APC和淋巴器官的疫苗佐剂和输送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者引导至专门针对covid-19疫苗的mRNA递送系统的综述中[24,25]，以及mRNA疫苗的临床表现[26]。免疫刺激性佐剂通过引起先天免疫反应，连接抗原表达与获得性免疫诱导从而提高疫苗接种的效率和持久性[27]。在重组蛋白或编码蛋白质的核酸衍生的现代疫苗中佐剂的作用越来越重要。值得注意的是，这些活体入侵和灭活疫苗缺乏许多病原体相关的分子模式（PAMP），才需要佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂被整合到可离子的基于脂质的脂质纳米颗粒（ILNPS）制剂中作为内置佐剂，而不是额外补充[28]。实际上，在小鼠[20]和人类[29]中对mRNA ILNP的强烈先天免疫反应在疫苗功能中起着至关重要的作用[19]。mRNA疫苗中ILNP和mRNA分子的脂质成分都能起到佐剂效果[30]。内置佐剂方法使mRNA疫苗制剂简单专一[31]，从而促进流畅的临床翻译。此外，专一的配方可以使抗原mRNA和佐剂的共递送到相同的APC中，从而有效激活在APC中使递送的mRNA表达抗原蛋白。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究证明了共同递送抗原和佐剂的优点[32,33]。在一项开拓性研究中，共包装了CpG DNA和卵脂蛋白（OVA）的聚（D，L-乳酸-共糖苷）（PLGA）微球在小鼠诱导产生抗原特异性细胞毒性T细胞（CLT）方面比分开包装两种成分表现出色[32]。尽管佐剂在疫苗中具有关键作用，但过量和意外的佐剂会带来安全问题并对疫苗产生负面影响，所以佐剂必须能精确的以最佳强度激活正确的信号通路。本节通过佐剂视角了解mRNA疫苗发展和机制理解。mRNA通过几种先天免疫受体从未触发先天性免疫反应，这些受体包括内体中的Toll样受体（TLR）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1（a））。每种受体适配不同的配体，TLR3适配大于45个碱基对（bp）的双链RNA（dsRNA）[34]，TLR7、8适配大于20个核苷酸（nt）的单链RNA（ssRNA）[35]，MDA-5适配数千bp的dsRNA[36]，而RIG-I适配大于20 nt的含有5'末端三磷酸基团的dsRNA[37]。这些受体的主要适配分子基本都包含Toll/白细胞介素-1（IL-1）受体结构域，包括TLR3的适配分子诱导性的干扰素-β（IFN-β），TLR7、8的适配分子髓系分化初级响应子88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的适配分子线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）[38]。这些分子最终诱发I型干扰素和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽子结构是区分自身和非自身mRNA的关键。5'帽子结构根据前两个核苷酸核糖中的2'O-甲基化状态进行分类。Cap0的前两个核苷酸中2’O-位置不甲基化，Cap1的第一个核苷酸中2’O-位置甲基化，Cap2的前两个核苷酸中2’O-位置均甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，而通过RIG-I识别外源的Cap0 mRNA[39]。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力[40]。体外转录的mRNA杂质中，包括未加帽和长的dsRNA，会诱导强烈的先天性免疫反应。通过体外转录制备的无盖RNA在5'末端有一个三磷酸基团，可以刺激RIG-I。尽管最新的CleanCap技术提高了加帽效率[41,42]，但CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然会明显激活先天性免疫反应。事实上，使用磷酸酶处理CleanCap mRNA溶液可以去除未加帽mRNA的5'三磷酸基团，显著降低了培养的巨噬细胞中的细胞因子反应[43]。这一结果突显出了未加帽mRNA污染物的免疫刺激作用。作为先天免疫的强诱导剂[44]，长dsRNA是在体外转录过程中以RNA为模板转录产生。在这个过程中由DNA模板转录出的目的mRNA链充当模板，合成互补的非目标RNA链[45,46]，从而形成长dsRNA。如下文所述，对这些杂质的先天性免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗的效果[47]，需要重点根据这些杂质的免疫刺激考虑疫苗的效果。尽管mRNA疫苗需要先天性免疫响应作为佐剂，但过度的响应会引起安全问题，并对疫苗效果产生负面影响，具体后稍后阐述。此外，细胞响应外源mRNA会诱导全局性mRNA的降解并抑制翻译起始，从而影响蛋白质表达效率（图1（a））。2'-5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）对mRNA的识别以及RNase L的激活后会导致大量细胞内ssRNA降解[48]。此外，RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译起始因子2-α（eIF-2α）的激活来会抑制外源mRNA的蛋白质翻译的起始过程[49]。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感应。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1甲基假尿苷修饰的核苷（1 mΨ），以减轻mRNA引起的先天性免疫反应[16,38]。此外，使用高效液相色谱法（HPLC）移除dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA中5'三磷酸，也可以减少mRNA杂质的免疫刺激[38,43]。最近的mRNA纯化技术基于帽类似物上的光剥离性疏水标签从未加帽的mRNA中纯化出加帽mRNA,并使用产生最少dsRNA的工程RNA聚合酶[51]。这些方法通过增加抗原蛋白翻译及减轻促炎反应提高mRNA疫苗的安全性和有效性。iLNP制剂是当前mRNA疫苗中广泛使用的平台，其脂质成分是先天性免疫反应的主要诱导剂。事实上，没有包封RNA的空iLNP在局部注射到小鼠体内后诱导了强烈的促炎反应[19,52]。值得注意的是，在去除可电离脂质成分后，促炎反应几乎没有，表明了可电离脂质在免疫刺激中的关键作用。可电离脂质在细胞外pH下为中性，在内/溶酶体pH下带正电荷。因此，不响应pH的可电离脂质比传统阳离子脂质促炎性更小，因为使用可电离脂质代替阳离子脂质可以减少LNP与细胞膜的相互作用以及引起的膜损伤[22]。相反，用阳离子脂质替代iLNP中的可电离脂质会降低对纳米颗粒的先天免疫反应[19]。一些研究提供了iLNP激活先天免疫的机制（图1（b））。如下文所述，几种可电离的脂质特异性激活先天免疫受体，包括TLR和细胞内干扰素基因的刺激因子（STING）[53-55]。此外，对mRNA iLNP和其他纳米颗粒的研究表明，作为mRNA递送的重要细胞内过程，溶酶体破裂通过炎症小体激活诱导先天性免疫反应[56,57]。注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMP），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后激活先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究显示，在肌肉内（i.m.）注射新冠肺炎mRNA疫苗BNT162b2后，血清中DAMP的水平急剧升高，包括双链DNA、高迁移性组合群（HMGB）1和尿酸[20]。在人类中上市的新冠肺炎mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应[3，4]，可能会导致DAMPs的释放。本节聚焦iLNP讨论先天性免疫反应如何影响疫苗效果。最近的一项研究调查了敲除各种受体的小鼠，在注射新冠肺炎mRNA疫苗BNT162b2后，多种先天免疫受体在诱导体液免疫和细胞免疫中的作用[20]。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症小体中的NLR家族PYD结构域含蛋白（NLRP）3和含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC）的凋亡相关斑点样蛋白，以及TLR2、TLR4、TLR5、环GMP-AMP合酶（cGAS）和STING，其中一些是可电离脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5的敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞。更确切地说，MDA-5的敲除减少了MDA-5信号传导的下游分子IFN-α的分泌，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFNα/β受体（IFNAR）1的敲除也影响了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞响应中的关键作用。MDA-5可能将mRNA疫苗制剂中或受损细胞释放的dsRNA识别为DAMPs。图1 mRNA疫苗诱导的先天性免疫。（a） 外源RNA受体及信号通路。ppp-dsRNA：5'末端具有三磷酸基团的双链RNA。（b） iLNP脂质成分的先天免疫响应潜在机制。然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。敲除上述任何先天性免疫受体都不会降低spike-特异性抗体诱导的效率。此外，只有敲除IFNAR1后，检测到spike-特异性抗体的轻微减少。这与一项关于人体研究的结果一致[58]。这项人体研究评估了新冠肺炎mRNA疫苗对缺失TLR7、IFNAR1、干扰素调节转录因子（IRF）7或I型IFN自身抗体造成的先天或后天缺乏I型干扰素信号途径患者的效率。RNA疫苗在这些患者中有效地诱导中和抗体和记忆B细胞的水平与健康对照组相当。同时，一些动物研究为体液免疫诱导的关键途径提供了见解。敲除编码众多TLR衔接蛋白的基因MyD88，接种mRNA iLNP疫苗对抗原特异性卵泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导急剧下降[19]。此外，敲除编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的基因白细胞介素（IL）-6也消除了疫苗接种的效果。然而，敲除编码编码RIG-I和MDA-5衔接蛋白的基因AVS后，疫苗接种效果仍得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用[59]，发现IL-6敲除会损害Tfh细胞和GC B细胞的抗体反应和诱导。同时，在IL-6敲除后，saRNA疫苗对致命流感病毒攻击的保护作用得以保留。这些研究表明，诱导体液免疫反应的先天免疫信号通路存在冗余，而TLR和IL-6起着主导作用。在人类疫苗接种中，第二剂新冠肺炎mRNA疫苗显著增强体液和细胞免疫，同时诱导出比第一剂更严重的全身反应原性[3，4]。这一观察表明，第二针后的负责反应原性的促炎分子也可能有助于增强适应性免疫。之前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆谱中67种细胞因子。其中，IFN-γ急剧增加，特别是在第二剂后[29]。接种第二针后小鼠模型中IFN-γ水平同样急剧增加，同时伴有巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活[20]。进一步的分析显示，CD4+和CD8+T细胞对第二针后产生IFN-γ有很大作用。有趣的是，施用IFN-γ受体中和抗体抑制了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的活化，表明IFN-γ在第二针后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+和CD8+T细胞诱导的效率影响最小。因此，需要进一步研究解析新冠肺炎mRNA疫苗的佐剂机制。iLNP佐剂性的另一个关键问题是，哪种脂质和mRNA成分主要有助于免疫刺激，以及每种成分激活的信号通路是什么。一项综合的机制研究通过比较空iLNP和包封修饰mRNA的iLNP来解决这个问题[19]。有趣的是，两种制剂在小鼠皮内注射后4小时和24小时在引流淋巴结中产生了相似水平的细胞因子和趋化因子，表明脂质成分在针对iLNP的先天免疫反应中起着主要作用。因此，iLNP不仅起到佐剂作用，还可以提高了重组蛋白疫苗的效力，使其比AddaVax更有效地产生抗原特异性抗体，AddaVax是一种模仿临床批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂。有趣的是，空壳iLNP佐剂效应在MyD88和MAVS敲除后基本保持不变，但在IL-6敲除后有所下降。因此，空壳iLNP可能通过IL-6的分泌发挥其佐剂功能。然而，同一研究中的详细分析揭示了mRNA对mRNA-iLNP引起的先天免疫中的作用，即使mRNA被化学修饰以尽量降低免疫刺激。当比较空壳iLNP和包裹mRNA的iLNP对提高重组蛋白疫苗效果的佐剂功能时，MyD88（一种编码许多TLR衔接蛋白的基因）的敲除降低了mRNA-iLNP引起的体液免疫诱导，但对空壳iLNP没有。这一结果表明，激活MyD88的是mRNA，而不是脂质成分。在另一项研究中，在非人类灵长类动物（NHP）体内肌肉注射和皮内接种后，只有包封修饰mRNA的iLNP诱导引流淋巴结中树突状细胞的i型IFN表达和树突状细胞的成熟[60]，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的重要作用。使用未修饰的mRNA和较小的免疫刺激mRNA递送载体后，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，癌症疫苗临床试验中使用的阴离子脂质体的免疫刺激性低于iLNP[61]。有趣的是，阴离子脂与未修饰的mRNA时引发了强大的CTL活性[8,9,62]，但相反，当包裹1 mΨmRNA时诱导了抗原特异性免疫耐受[63]。这些研究强调了未修饰mRNA将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗的佐剂作用。在接种包裹未修饰mRNA阴离子脂质体后，TLR7和IFNAR1的敲除降低了树突状细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的活化，但敲除TLR3、4和9不会[62]。这一结果表明，TLR7对mRNA的识别以及随后I型IFN的激活在未修饰mRNA的佐剂性中起着重要作用。至今回顾的对于机制的理解表明，提高mRNA疫苗佐剂性获得的益处促使了该领域的研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性可能决定疫苗的接种效果，而不是抗原表达效率，其中使用加强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗效果优于低效率免疫刺激和加强抗原表达的免疫疫苗[76,90-92]。在设计mRNA疫苗佐剂时，会优先选择含有抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗制剂，实现抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究表明，共递送抗原和佐剂对强效疫苗有益[32,33]。此外，这种简单的疫苗制剂有利于临床翻译。图2 提高mRNA疫苗佐剂性的策略。（a） iLNP或其他脂质系统。（b） 一种含有磷酸钙核心的脂质载体。（c） 聚合物。（d） 鱼精蛋白/mRNA复合物。（e） 包被甘露聚糖的空心糖胶囊。（F） 设计mRNA以提高佐剂性。粗体突出显示增强佐剂功能的成分。一种策略是将佐剂和mRNA包封至同一纳米颗粒中。基于脂质的系统有两种选择：在水相中包封亲水性佐剂或在脂质相中包封疏水性佐剂（图2（a））。前一种方法的例子是iLNP包封锰，锰是STING途径的激活剂，在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型疫苗方面表现出预期结果[67]。在后一种方法中，将TLR7/8激动剂小分子R848与棕榈酸偶联，并掺入阳离子mRNA脂质体[69]。脂质体表现出强大的CTL诱导和抗癌作用。在另一个案例中，由半胱氨酸、硫代甘油和两条棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂Pam2Cys，被掺入iLNP中，从而增强细胞和体液免疫反应[70]。其他系统利用α-半乳糖神经酰胺，其在呈递到APC后激活永久的自然杀伤T（NKT）细胞，证明其在抗癌症[71]和疟疾疫苗中的实用性[72]。疟疾疫苗靶向感染的肝细胞。除了使用额外的佐剂外，在以脂基为基础疫苗中也可以选择将佐剂掺入可电离或阳离子脂质（图2（a））。在没有额外佐剂的情况下，这种方法通过最小化各成分简化了疫苗配方，可能有利于临床翻译。佐剂性的脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，与线性胺头部组相比，具有环状胺头部基团的可电离脂质与具有线性氨基基团的可电离脂质相比，能更有效地诱导针对癌症的先天免疫反应和抗原特异性CTL活性[53]。有趣的是，STING的敲除消除了环胺iLNP诱导的先天性和适应性免疫反应，表明可电离脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了一种可生物降解的酯键连接子，以安全的促进佐剂环胺的清除[76]。另一项研究开发了一种能够激活TLR4[54]类似阳离子脂质的材料。基于此脂质的疫苗改提高了野生型小鼠的细胞免疫，但在TLR4敲除小鼠中没有变化，表明TLR4参与了疫苗的信号传导。将现有的佐剂或其成分与可电离的脂质偶联是一种更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂连接的可电离脂质体佐剂，提高了细胞和体液免疫的诱导效率[55]。另一项研究将维生素E（临床批准的佐剂AS03的一种成分）连接至可电离脂质的疏水尾部[77]。与具有肉豆蔻酸或油酸尾的对照可电离脂质相比，含有维生素E的可电离脂质显示出增强的诱导CTL反应的佐剂性能。在脂质为基础的制剂中使用无机系统行使递送和佐剂的功能也是一种例子。之前的一项研究设计了由脂质层包裹负载mRNA的磷酸钙核心的纳米颗粒（图2（b））。磷酸钙核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+[79]。细胞内Ca2+浓度的增加触发了树突细胞成熟的信号传导。此外，磷酸钙核心可以共包裹抗原mRNA和PD-L1 siRNA，以阻断免疫检查点，进一步增强癌症疫苗效果。与基于脂质的递送系统相比，基于聚合物的递送系统也是一大类mRNA递送系统[23,93]，但作为mRNA疫苗制剂的关注较少。之前一项研究比较了多聚体和iLNP递送saRNA的疫苗效果[91]。有趣的是，通过肌肉注射后iLNP递送的saRNA比多聚体递送的saRNA在诱导细胞和体液免疫上更为出色，尽管多聚体比iLNP的递送产生了更高效的抗原表达。一致认为，iLNP在诱导mRNA疫苗佐剂功能的关键分子IL-6表达上比多聚体更有效[19]。因此，作者认为低佐剂性造成了的低的疫苗效率，尽管淋巴组织的递送效率等因素也可能影响疫苗接种结果。同时，一些多聚体系统在疫苗方面也表现出积极的结果（图2（c））。几个临床试验中使用的鱼精蛋白/mRNA复合物利用未修饰mRNA的佐剂性来刺激TLR7（图2（d））。在该系统中，与小鼠腹腔注射裸mRNA相比，注射鱼精蛋白及mRNA复合物提高了先天性免疫反应，但降低了抗原表达效率[80]。因此，通过控制mRNA和鱼精蛋白的混合比使注射溶液中包括游离mRNA和鱼蛋白/mRNA复合物，以同时实现抗原表达和佐剂功能。在一项机制研究中，TLR7敲除几乎完全抑制了多聚复合物给药后IL-12的分泌。此外，通过敲除TLR7降低了多聚复合物诱导CTL的潜力，而TLR9却不能，突出了TLR7在该疫苗制剂中的佐剂作用[94]。在另一个例子中，二氧化硅纳米粒子被聚乙烯亚胺（PEI）包被，随后进行PEI交联、mRNA负载和甘露聚糖包被[81]。随后，去除二氧化硅核心，得到空心糖胶囊（图2（e））。甘露聚糖能作为佐剂靶向树突细胞并激活树突细胞。因此，该系统为癌症疫苗引起了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还表明了聚阳离子佐剂在mRNA疫苗中的潜力（图2（c））。例如， 一种200kDa 的mRNA复合物阳离子壳聚糖也可用作佐剂，通过激活STING和炎症小体来增强抗原特异性的细胞和体液免疫[82]。在另一项研究中，具有C18侧链的聚阳离子因为其具有激活树突细胞的佐剂和有效的淋巴结迁移[83]，在癌症疫苗上表现出良好效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了聚阳离子佐剂的活性。在这项研究中，鼻内给药后PEI通过从宿主细胞释放DNA作为DAMPs发出信号激活IFN，从而发挥其佐剂作用[95]。这些研究展示了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这一潜力尚未得到充分探索。如前所述，iLNP也会产生DAMP[20]，其可能作为佐剂分子。同时，DAMP的过量可能引发自身免疫性疾病。例如，自身DNA过度激活cGAS STING通路可能会导致Aicardi-Goutières综合征和共济失调毛细血管扩张症[96]。疫苗开发需要考虑这些风险。调节mRNA佐剂性为提高疫苗效果提供了另一种选择。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激蛋白的mRNA以及利用RNA分子的内在免疫刺激特性（图2（f））。这些策略可以使用单个纳米颗粒制剂共同递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内会发生酶降解，从而避免了长时间的免疫刺激[11,12]。关于编码免疫刺激蛋白的mRNA，一项开创性研究将抗原mRNA与编码免疫刺激的CD40配体、组成型活性形式的TLR4和CD70的三种mRNA混合。与鼻内注射单独抗原mRNA相比，该设计显著提高了抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的诱导和抗癌效果[84]。最近的研究证明了免疫刺激mRNA在iLNP制剂中的优点。例如，之前的一项研究发现，通过筛选编码参与先天免疫信号传导的蛋白质的各类mRNA，组成型活性STING的 mRNA在小鼠中诱导CTL活性方面最为有效[85]。另一项研究采用了编码C3d（种哺乳动物补体成分）的mRNA，可以激活滤泡树突状细胞和B细胞[76]。包裹C3d mRNA的iLNP可以提高抗原特异性细胞免疫和体液免疫。RNA分子固有的免疫刺激组分，特别是dsRNA分子可以被用作佐剂。在这方面，dsRNA的免疫刺激特性可以对saRNA疫苗的效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我复制，从而延长抗原蛋白的表达[1,87]。此外，细胞内复制过程中产生的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，从而诱导先天免疫反应。这些特征使在动物和人类中低剂量saRNA[97,98]疫苗有效性的可能。然而，dsRNA中间体的持续存在可能延长免疫刺激和PKR激活，在某些情况下可能对疫苗效果产生负面影响。事实上，敲除IFNAR1或MAVS提高了saRNA疫苗诱导体液或细胞免疫的效率[99，100]。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a可以提高疫苗效率，ORF4a抑制了dsRNA[86]结合DA-5和RIG-I的活性，或者通过阻断PKR和IFN-β活性抑制痘苗病毒免疫侵袭蛋白[87]。相比之下，使用dsRNA瞬时刺激先天免疫反应有利于mRNA疫苗提高CTL活性。在这种策略中，通过与非复制mRNA的杂交互补制备dsRNA（图3）。以前的研究评估了RNA回补杂交对mRNA在蛋白质翻译效率和先天免疫响应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区时，17nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3（a）），但在23nt或更长的RNA杂交后，翻译效率降低（图3）[101]。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特异性地与mRNA分离，这可能是翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性造成的[102]。这一过程可能允许与17nt互补RNA链杂交的mRNA高效的表达蛋白质。在佐剂性能方面，23nt或更长的互补RNA的杂交能提高mRNA的免疫刺激特性，但17nt的互补RNA却不能。同时，当靶向mRNA的非编码区时，RNA杂交的影响也不同。之前的一项研究中通过体外转录制备的120nt poly U RNA与mRNA的120nt poly a杂交[88]。有趣的是，poly-U杂交大大增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，而对翻译效率的影响很小（图3（c）），提供了一种具有优秀佐剂性能mRNA的形式。机理分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120nt的poly-U RNA在体外转录时没有5'cap类似物，在5'端有一个三磷酸基团，其是RIG-I的配体。在小鼠接种中，这种制剂以裸形式递送抗原mRNA的增强了疫苗接种效果。然而，该系统中免疫刺激的强度是不可控的。因此，后来的一项研究重新设计了该系统，以实现免疫刺激强度的微调[89]。为此，通过将mRNA与17个核苷酸的互补RNA杂交得到受控数量的dsRNA链，制备梳状结构的mRNA（图3（d））。dsRNA齿精确的用于诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激的齿数能够微调佐剂性，从而最大限度地提高疫苗疗效，同时将不良反应降至最低。最终，该系统提高了三种不同mRNA制剂的CTL活性：阴离子脂复合物，iLNP和聚乙二醇化多聚物。图3 mRNA与dsRNA佐剂杂交。RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激效果如示意图。（a-c）互补RNA杂交至mRNA的编码区域（a,b）和poly A(C)。（d）靶向RIG-I的dsRNA在mRNA编码区域杂交形成齿状结构mRNA上述描述侧重于mRNA疫苗在先天免疫反应的益处。然而，许多研究揭示了佐剂性能更复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗中表现出复杂的结果。Ψ和1mΨ等mRNA修饰减轻了mRNA的先天免疫反应，即佐剂性。而未修饰的mRNA在佐剂性能上对CTL诱导和抗体产生相反的影响。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+T细胞反应方面比修饰的mRNA更有益[92103]。根据最近的一项研究，与包封1 mΨ修饰的抗原mRNA的iLNP相比，包封不经核苷修饰抗原mRNA的iLNP能更有效地诱导抗原特异性CD8+T细胞，包括对颗粒酶B呈阳性的CD8+T细胞和活化肿瘤浸润树突状细胞[92]。因此，在小鼠模型的癌症疫苗中，未修饰的mRNA优于修饰的mRNA，表现出对肿瘤体积的有效抑制并且延长小鼠的存活时间（图4（a））。值得注意的是，在使用编码荧光蛋白mRNA的报告中发现，与1 mΨ修饰的mRNA相比，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中报告蛋白的表达效率要低得多（图4（b））。这些结果表明，即使以牺牲抗原表达效率为代价，未修饰的mRNA也有可能诱导CTL反应。机制分析发现未修饰的mRNA比修饰的mRNA能更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体降低了未修饰mRNA为疫苗带来的益处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂作用。![]()
相反，与未修饰的mRNA相比，iLNP递送的1 mΨmRNA产生更多的抗原特异性抗体，展现出了未修饰mRNA佐剂性的负面效果。一项综合研究调查了在小鼠中1 mψ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗的影响[104]。静脉注射疫苗后，1 mΨmRNA在诱导抗原特异性CD4+T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），同时脾脏中Tfh和GC B细胞增多。这些结果可能反映了未修饰mRNA佐剂性的负面性。同时，1 mΨmRNA比未修饰的mRNA更有效、更持久的表达报告蛋白（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白质表达效率的提高因器官和细胞类型而异，尤其是在脾脏免疫细胞中，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞[105]。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提高抗原表达的能力也可能有助于其提升其疫苗潜力。最近的一项工作使用三种不同的iLNP在小鼠和NHPs中研究修饰1 mΨ的效果，为研究先天免疫反应和抗体生产效率之间的相关性提供了机制上的见解[106]。在这项研究中，1 mΨ修饰提高了抗体产生效率，同时减少了趋化因子和细胞因子的全身分泌。更进一步分析，在三种iLNP中，没有1 mΨ修饰的两种iLNP诱导了强烈的I型IFN分泌，而1 mψ修饰后获得的iLNP疫苗效率更佳，另一种iLNP在没有修饰时表现出最小的I型干扰素反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。![]()
mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近一项关于iLNP mRNA疫苗的研究中，C57BL6小鼠表现出比BALB/c小鼠弱得多的体液免疫诱导[47]。比较两种种系，来自C57BL6小鼠的树突细胞产生的I型IFN的量比来自BALB/c小鼠的树突状细胞多10倍以上。通过HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中IFN的产生受到抑制，C57BL 6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠中观察到的水平相当。这些数据还表明I型干扰素对体液免疫诱导的抑制作用。如上所述，在人类中I型干扰素信号通路的缺乏不会影响严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型mRNA疫苗抗体的产生。因此，在人类中抗体的产生可能不需要强佐剂性和I型IFN激活。从安全的角度来看，在NHP中接种iLNP-mRNA疫苗, 1 mΨ修饰降低了细胞因子和趋化因子的系统性释放[106]。因此，对于侧重于体液免疫的疫苗，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗实际上更为可取。同时，还应注意化学修饰的必要性仍然存在争议。事实上，包裹未修饰mRNA的iLNP在NHP中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的装载1 mΨmRNA的新冠肺炎疫苗诱导的水平相当[107]。除了核苷修饰外，CTL诱导的I型IFN信号传导提供了佐剂作用背后复杂机制的另一个例子。值得注意的是，I型干扰素信号传导相悖于CTL诱导，具体取决于疫苗给药途径。IFNAR1敲除或IFNAR1阻断抗体提高了局部递送（包括i.d.、皮下（s.c.）和结节内递送）后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，表明i型IFN信号传导对疫苗有负面影响[108109]。重要的是，即使mRNA的蛋白质表达效率没有大幅提高，IFNAR1阻断也能改善疫苗效果。因此，除了抗原表达效率机制外，可能是I型IFN信号的过度佐剂性损害了疫苗的效果。相反，IFNAR1敲除降低了系统注射后CTL诱导的效率，显示出了I型IFN佐剂性的正向作用[110]。根据后来对疫苗I型干扰素信号传导的机制研究，在CD4+T细胞中条件性的敲除IFNAR1后，局部递送后的负面影响和全身递送后的正面影响都被消除了，但在树突状细胞中却没有[111]。因此，I型干扰素对CD4+T细胞的作用解释了其对疫苗双面的影响。I型IFN信号传导和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着至关重要的作用[112]。抗原呈递至T细胞受体之前，I型IFN信号传导对T细胞具有抗增殖和凋亡作用。另一方面，延迟的I型IFN信号传导对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学的差异解释了I型干扰素在全身和局部给药之间的相反作用。全身给药可能会将mRNA直接递送到脾脏树突状细胞中，与I型干扰素相比，实现了快速且持久的抗原呈递，从而激活了T细胞。另一方面，局部给药需要时间让组织残留的APC迁移至淋巴器官。这会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。最近的一项研究显示，iLNP对先天性和适应性免疫反应的影响可持续数周[113]。有趣的是，预先注射载有非抗原mRNA的iLNP或空iLNP会降低2周后注射iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6（a，B））。当注射前到接种疫苗之间的间隔从2周增加到8周时，抑制作用仍然存在，但程度较低。预注射降低了mRNA iLNP疫苗的抗原表达效率，这可能有利于抑制作用。进一步的机制解析通过评估iLNP预注射对感染性疾病的保护作用，研究了先天免疫对这种抑制效果的影响。在这个实验中，接种含有非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白念珠菌感染，这种感染由先天免疫决定（图6（c））。有趣的是，预注射对流感病毒具有保护作用（图6（d）），但加剧了白念珠菌的感染（图6）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可以解释白念珠菌的加剧，而流感病毒挑战实验中涉及的机制尚不清楚。重要的是，这两个结果都表明，iLNP注射对以下传染病的先天免疫反应具有长期影响。iLNP对后续疫苗的抑制作用可能具有临床意义。新冠肺炎疫苗在人体中的效力通过延长初始剂量和加强剂量之间的间隔得到改善[114]。最初剂量对增强剂量的抑制作用解释了这一临床结果。图6 预注射iLNP对后续先天免疫和适应性免疫反应的影响总的来说，本节讲述了过度佐剂性阻碍疫苗效果的例子，而佐剂性是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所述。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂的双面性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂的后果。疫苗的有效性需要在淋巴器官（包括淋巴结和脾脏）中的抗原呈递细胞APC与诱导获得性免疫的T细胞和B细胞合作[115]。mRNA疫苗有两种主要途径在淋巴器官的APC中实现抗原表达（图7）。一种途径中，非淋巴组织中接种mRNA疫苗后，残留的APC在注射部位吸收抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要几个小时到几天。在具有少量APC的组织中，该途径需要免疫细胞迁移至注射部位，该过程为mRNA疫苗触发的先天性免疫反应。将mRNA疫苗递送到富含APC的组织，如皮肤组织，便是利用此途径的一种方法。在另一种途径中，疫苗纳米颗粒穿过淋巴管，将mRNA直接输送到淋巴组织中的APC，这需要几分钟到几小时的时间。值得注意的是，淋巴管会通过对流促进该过程。该途径需要具有合适淋巴转运的尺寸和表面特性的纳米粒子。此外，靶向配体也可以帮助疫苗在淋巴组织中积累和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全的角度来看，疫苗在淋巴器官中的停留是必需的，以避免疫苗转移到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活。以下部分提供了mRNA疫苗中的递送视角，重点介绍递送途径和纳米粒子设计（表2）。每一节首先对每种疫苗接种途径进行总体描述，然后再重点介绍mRNA疫苗。临床上大多数疫苗都采用肌肉或皮下组织注射，尽管这些组织在很少有APC[134]。因此，APCs浸润至注射部位需要吸收疫苗，并由趋化因子梯度迁移到近端引流淋巴结，以促进获得性免疫反应的共激活。此外，疫苗可以通过淋巴管直接传输到这些淋巴结。与皮下注射相比，肌肉注射在注射部位发生不良事件的风险较低，并诱导更强烈的免疫反应[135]。肌肉组织在血管和淋巴循环中通常更为丰富，这使得疫苗能够有效地运输到淋巴结[136]。这解释了肌肉注射在疫苗接种中对于皮下注射的优势。相比之下，皮下注射的疫苗往往会在注射部位停留很长时间，这可能是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下注射疫苗的途径依赖于APC向淋巴结的迁移，而不是疫苗的迁移。在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究探讨了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定其在间质给药后的命运。特别是，它们的大小和表面特性，如电荷和亲水性，是其淋巴结移位的决定因素[137138]。粒径在10至100 nm之间，尤其是20至50 nm，适合穿过间质并进入和穿过淋巴管[139]。然而，尺寸为100-200nm的纳米粒子在淋巴结中的迁移较差，因为大约100nm大小的水通道限制了它们在间质中的扩散和对流[140]。尺寸超过200 nm的纳米粒子留在注射部位，完全依赖APC的摄取和APC向淋巴结的迁移来提供疫苗效果[141]。相比之下，小于10nm的纳米粒子更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为其尺寸允许穿透毛细血管壁[140，142]。此外，毛细血管中的流量大约是淋巴流量的100-500倍，这有助于纳米颗粒的清除[143]。对于纳米粒子的表面特性，带正电的纳米粒子在注射部位被带负电的细胞膜和细胞外基质包埋[144，145]。相比之下，缺乏这种局部相互作用的负电荷或不带电荷的纳米粒子可以通过淋巴管到达淋巴结，对于疫苗较为合适[146]。用亲水性隐形材料（包括聚乙二醇（PEG））覆盖纳米粒子表面可以进一步提高纳米粒子向淋巴结的迁移效率，因为这些表面与间质基质的相互作用最小[147-149]。图7 iLNP mRNA疫苗肌肉注射后的潜在机制。有趣的是，聚乙二醇化使超过100纳米大小的纳米颗粒易位，如120纳米的阴离子脂质体[150]和250纳米的阳离子脂质体[151]，这是因为聚乙二醇化可以提高纳米颗粒的胶体稳定性，减少其在注射部位对间隙环境的非特异性吸附[152]。同时，纳米颗粒表面的聚乙二醇密度需要优化。例如，与含有5 mol% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体相比，含有1mol % DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的滞留时间更长，被抗原呈递细胞的摄取增强，同时两种脂质体都有效地迁移至淋巴结[151]。另一项研究也揭示了PEG密度优化对疫苗效果最大化的重要性[138]。针对APC的配体，如甘露糖衍生物[153]和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体也可以提高APC的递送效率[154]。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性[137]。考虑到apc的高吞噬活性及其在淋巴结中的丰度[155]，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的apc，调整其物理化学性质就足够了。纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结可产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他递送途径(包括id、sc和近淋巴结注射)中未能诱导出可检测的疫苗效果[156]。在靶向新抗原癌症疫苗的临床试验中结内裸mRNA注射也显示出良好的结果[157]。这些研究突出了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，在超声成像的引导下，结内注射艰巨的过程阻碍了临床的广泛应用。相比之下，在普通医疗情况下进行的s.c.和i.m.等局部注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应具有在递送至非淋巴组织后诱导淋巴组织APCs抗原表达的能力。促进mRNA疫苗和apc的淋巴结迁移是实现这一目的的两个主要途径(图7)，而这些途径往往难以区分。有趣的是，在静脉注射mRNA-iLNPs后可在引流淋巴结高效产生表达抗原的apc，这是上市的COVID-19 mRNA疫苗高效的原因之一。以往的研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层扫描追踪了NHPs中放射性标记的iLNP[158]。注射后4小时内，iLNP在距注射部位9.2 cm的淋巴结处表现出强信号。其他研究通过观察注射iLNP后小动物和大动物体内mRNA的分布和报告蛋白的表达，在细胞水平上进一步了解mRNA-iLNP局部递送后的过程[11,60]。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中表达报告蛋白。注射后8 h，报告蛋白在引流淋巴结中有效表达，而在非引流淋巴结中没有表达。注射后7 d，表达量逐渐下降，但仍高于检测限。在淋巴结的各种细胞类型中，包膜下和髓窦的巨噬细胞具有较强的报告蛋白表达，而树突状细胞和单核细胞中表达效率较低，在T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为apc，通过与T细胞和B细胞相互作用触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人的引流淋巴结在免疫接种后高效积累疫苗mRNA和表达抗原蛋白[12,159]。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结获得抗原表达的两种途径，即iLNP和apc的迁移(图7)，但iLNP在远端淋巴结的快速积累表明了iLNP迁移的作用。此外，iLNP在包括肝脏和脾脏在内的全身器官中诱导了强大的蛋白质表达[10]，可能是iLNP迁移而不是APC迁移的原因，这突出了iLNP在注射部位外移动的潜力。一些研究尝试进一步区分这两种途径的贡献。为此，最近一项研究制备了一种注射部位抗原蛋白表达效率高、引流淋巴结表达效率低的系统[160]。mRNA和空iLNP的混合物在注射部位表达了一定水平的蛋白质，但与注射包裹mRNA的iLNP相比，其在引流淋巴结中的表达水平要低得多。值得注意的是，mRNA和空iLNP的混合物诱导的体液和细胞免疫的效率低于iLNP-mRNA。这些结果表明免疫接种中淋巴结抗原表达的显著作用。虽然本研究不能精确区分iLNP和apc的迁移，但我们可以合理地假设，包裹mRNA的iLNP比mRNA和空iLNP的混合物能更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，iLNP迁移到引流淋巴结对疫苗具有重要作用。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA-iLNPs的大小也可能影响其疫苗效果。基于此，之前一项研究使用小鼠的135个iLNP批次研究此问题，结果显示抗体产生效率与iLNP大小之间存在明显的相关性[161]。结果验证了免疫过程中iLNP向淋巴结的迁移。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖结构的差异。另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，发现每种制剂的靶细胞类型都会影响体液免疫和细胞免疫的诱导效率(图8(a))[162]。与其他制剂相比，经静脉注射后，iLNP产生更高水平的抗体，但细胞免疫水平较低(图8(b))。在一项报告试验中，离子脂质体比其他脂质体更有效地诱导小鼠引流淋巴结中的蛋白质表达。在细胞实验中，iLNP在肌细胞中的蛋白表达优于树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中蛋白质表达更高。基于此，作者推测淋巴结中阳离子脂质体的有效积累和树突状细胞中有效mRNA递送有助于诱导强烈细胞免疫。相比之下，iLNP主要在肌细胞中表达蛋白质，随后apc吸收从肌细胞释放的抗原。这一过程较好地诱导了体液免疫。重要的是，抗原蛋白在非apcs中的表达有助于多种作用模式的疫苗效果[163]。当mRNA编码分泌抗原时，apc可以吸收非apc分泌的抗原。在质粒DNA (pDNA)疫苗的研究中，编码分泌OVA的pDNA在体外和体外裸注射后产生的抗OVA抗体水平高于编码膜结合或细胞质OVA的pDNA，表现出了分泌抗原的益处[164]。同时，在mRNA-iLNP疫苗中，编码细胞相关及分泌型血凝素(HA)的mRNA产生类似水平的抗HA抗体[165]，表明抗原分泌在此情况下的边缘作用。在另一种作用模式中，当表达抗原的非APCs在接种疫苗后受损时，非APCs的细胞碎片也可以为APCs提供抗原[163]。![]()
一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织进行有效接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了注射，该裸saRNA在皮肤温度范围(30-35℃)内进行复制，但在体温或高于37℃时失活[166]。裸RNA不会在注射部位以外分布，因为裸mRNA在迁移到其他器官的过程中可能被降解。此外，其他组织中的非最佳温度限制了saRNA的复制。即使这种疫苗配方仅在皮肤中表达，也能诱导出强大的细胞免疫。另一项研究表明，基于阳离子纳米乳化剂的saRNA疫苗即使在淋巴结或其他器官的分布极小也能强有力地诱导体液免疫[167]。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒表面，这与在脂质层内包裹mRNA的iLNP相反。本研究比较了阳离子纳米乳和iLNP的生物分布和疫苗效果。在小鼠体内注射后，纳米乳的蛋白表达主要限制在注射肌肉中，而iLNP则在引流淋巴结和肝脏中强烈表达蛋白质。然而，纳米乳诱导的体液免疫反应比iLNP更强，这表明疫苗中向淋巴结的迁移是不可或缺的。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布避免了全身炎症反应，而iLNP则诱导全身细胞因子释放和体重减轻。值得注意的是，最近的一项研究显示，mRNA-iLNP在NHPs中有大量的全身分布，注射后在脾脏、肝脏和血浆中都检测到注射的mRNA[11]。这种全身分布可能会引起人的安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎。一项自身免疫性肝炎的人体研究发现，肝脏中存在靶向刺突蛋白的CD8+ T细胞[116]。而接种mRNA后，T细胞可能会攻击表达刺突蛋白的肝细胞。关于心肌炎，一项对接种mRNA后死亡的患者mRNA分布的调查显示，在一些患者的心肌中存在疫苗来源的mRNA[12]。有趣的是，这些患者的心脏切片显示了巨噬细胞浸润导致心脏损伤的证据，而在心脏未检测到疫苗mRNA的患者中，这种变化的频率要低得多。这些结果显示出了心肌炎与iLNP在心脏的分布之间存在因果关系。尽管这些研究突出了mRNA疫苗全身分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗最好能越过注射部位到达淋巴器官。因此，研究人员尝试开发能够迁移到引流淋巴结而不发生全身渗漏的mRNA疫苗配方[55]。例如，之前一项研究使用可电离脂质库和具有四种脂质成分不同混合比例的iLNP[168]，根据引流淋巴结中的蛋白质表达水平进行筛选。与获批的疫苗BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中的表达增强，在肝脏或其他全身器官中的表达最少。另一项研究使用100 nm(小)、180 nm(中)和330 nm(大)的iLNP研究尺寸效应的机理[169]。注射后，小、中型iLNP从注射部位渗漏，在肝脏中积累并提供强烈的蛋白质表达，而大iLNP从注射部位渗漏最少。使用非iLNPs的递送系统也可能减轻mRNA疫苗的系统性溢出，因为iLNPs在肝脏积累中具有较强的机制。载脂蛋白E (ApoE)在血液循环中与iLNP结合，促进其被肝脏肝细胞上低密度脂蛋白受体的结合 [170,171]。如果没有这种机制，一些脂质复合物和脂质复合物不会在肝脏积累，但可以有效地递送到淋巴器官，从而实现安全有效的疫苗接种[10,83]。一项研究利用荧光素酶mRNA比较了肌肉注射后脂质聚合物与iLNP的分布(图9(A))。脂质聚合物在淋巴器官(包括淋巴结和脾脏)中高效表达荧光素酶，在肝脏中表达最少，而注射iLNP后肝脏则是表达荧光素酶的主要器官(图9(b))。在脂质聚合物注射后的定量PCR检测中，83%的mRNA留存在注射后的肌肉中，其余mRNA大部分分布在血液中，仅0.06%分布在肝脏中(图9(c))。这些结果展现了脂质体的分布概况。这种脂质复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强效疫苗效果，显示出对感染的保护作用。虽然存在系统性细胞因子释放以及白细胞短暂增加，但在疫苗安全可接受范围内。与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一种具有高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供很好的部位[172]。表皮中的免疫相关细胞包括角化细胞、apc(如朗格汉斯细胞)、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用，触发先天免疫和适应性免疫。角质形成细胞占所有表皮细胞的80%，其表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF)和促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子(IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α)促进免疫原环境的形成[117]。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。富含血液和淋巴管的皮肤环境吸引免疫细胞，并促进它们在促炎刺激下进入淋巴流，从而使疫苗有效地递送到淋巴结。真皮组织作为免疫器官的有利特征促进了多年来mRNA疫苗的开发。早期动物研究已经证明了鱼精蛋白/mRNA疫苗在预防传染病[118]和癌症[80]方面的潜力。在癌症疫苗的人体临床试验中，id鱼精蛋白/mRNA疫苗表现出可检测的抗原特异性T细胞反应[122]。此外，针对狂犬病毒糖蛋白的鱼精蛋白/mRNA疫苗在人体内的注射诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，并且没有严重的安全性问题[119]。即使在裸mRNA疫苗中，这种给药途径也显示出临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂，针对几种肿瘤相关抗原的裸mRNA疫苗通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了肾癌的进程[64]。最近，临床批准用于肌肉给药的基于ilnp的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273在临床试验中进行了注射后效果测试。注射10 μg或20 μg mRNA-1273产生的特异性抗体水平几乎与注射100 μg mRNA诱导的水平相当，这表明id注射会节省剂量[120]。临床研究评估了BNT162b2作为灭活疫苗接种者加强剂的接种效果。在这些研究中，1/5剂量的静脉注射和全剂量的静脉注射诱导的针对刺突蛋白的体液和细胞免疫反应几乎一样[121,173]。值得注意的是，与注射全剂量的BNT162b2相比，接种五分之一剂量的疫苗可以减轻全身反应原性。一项研究详细比较了NHPs进行i.D.mrna和i.m.mrna接种[60]。在针对流感病毒的基于ilnp的mRNA疫苗中，i.d.途径给药在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于i.m.途径。两种注射方式均导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，给药刺激了CD209+残余真皮apc的增殖。有趣的是，在用荧光标记的iLNP装载表达报告蛋白的mRNA后，CD1a+和CD209+真皮apc有效地吸收iLNP，报告蛋白表达长达9天，激活表达了CD80并迁移到引流淋巴结。这些表皮apcs可能会增强疫苗效果。最近的一项研究评估了Langerhans细胞和传统的1型树突状细胞(cDC1)在接种iLNP包裹的saRNA疫苗在这些细胞敲除小鼠中的效果[59]。缺乏这两种细胞类型的小鼠血清中诱导疫苗特异性抗体以及引流淋巴结中Tfh和GC B细胞的反应受损(图10(a))。有趣的是，那些缺乏任何一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果损伤，这表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗中的冗余作用。该研究还通过评估了有无中性粒细胞的疫苗效果，探讨了浸润中性粒细胞在疫苗中的作用。中性粒细胞缺失并未显著降低Tfh和GC B细胞的应答和抗体产生(图10(B))，表明浸润性中性粒细胞在id mRNA疫苗接种中的作用很小。图10 朗格汉斯细胞(LCs)和常规树突状细胞1 (cDC1)在皮内mRNA接种中的作用如图7所示，mRNA疫苗在淋巴结中获得APCs抗原表达的机制有两种:组织残留APCs向淋巴结的迁移和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节的疫苗研究表明证明了真皮组织残留apc的关键作用，前者机制的作用很大。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于注射途径。例如，之前saRNA疫苗的研究表明，id途径注射的疫苗效果与im途径相当或更低[174,175]。抗原蛋白表达效率、saRNA生物分布和佐剂性等因素可能是这些情况下疫苗效果的决定因素。皮内疫苗接种在临床上面临技术困难和不精确的注射。这一问题促进了新的注射方法和设备的发展[176，177]。其中，狂犬病毒的临床试验中使用了喷射注射器[119]。有趣的是，喷射注射鱼精蛋白/mRNA多聚体，而不是针头注射多聚体，诱导人类产生了可检测的抗体。这一结果揭示了喷射注射提高疫苗接种的益处，可能是提高了多组分的递送效率。微针为流感疫苗接种提供了另一种选择。例如，使用空心微针注射后，裸mRNA和脂质mRNA载体在猪皮肤中高效表达了报告蛋白，这使得液体能从每根针尖端的孔中注射[123]。最近的一项研究开发了含有mRNA iLNP的可溶解聚合物基质组成的微针[178]。微针插入皮肤后30分钟溶解释放iLNP。该系统对SARS-CoV-2表现出强大的疫苗效果，其水平与静脉注射iLNP相当。此外，该体系在室温下可耐受6个月，并且储存后蛋白质表达效率无明显下降。静脉注射的全身性给药是到达全身器官或组织的有效途径。与其他注射途径相比，其侵入性低，技术简单，普遍适用性强。值得注意的是，针对黑色素瘤[62]和结直肠癌[179]重组蛋白癌症疫苗全身给药具有很高的治疗效果。靶器官脾脏和淋巴结富含T细胞、B细胞和树突状细胞等免疫细胞的次级淋巴器官，在疫苗中起着关键作用[148,180]。尤其是疫苗的主要目标是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。在mRNA疫苗以外的领域，多年的研究已经解决了控制全身施用纳米颗粒生物分布的艰巨挑战。纳米粒子的物理化学性质决定了它们在全身给药后的生物分布。例如，纳米颗粒的直径应大于6 nm或分子量应大于50 kDa，以避免被肾小球滤过快速清除[181]。粒径在10至200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中聚集，因为肝脏是主要的清除器官[182]。这个大小范围与肝窦内皮细胞的孔径(50-200 nm)[183]和Kupfer细胞的吞噬活性相关[184]。此外，肝窦血流速慢有利于纳米颗粒被捕获到窦壁[185]，肝脏的高重量也是纳米颗粒在肝脏积聚的原因之一。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向性。在纳米颗粒表面包被生物相容性亲水性聚合物，如聚乙二醇或两性离子聚合物，可以有效减少肝脏对纳米颗粒的摄取[152,186]。肝窦内皮壁的聚乙二醇化，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏的积聚[187]。脾脏通过脾窦的内皮狭缝物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，过滤血液成分[188]，而微米大小的聚集体容易被肺微血管包裹[189]。此外，将纳米颗粒的表面电荷由正变为负[171]或用亲水性聚合物修饰可以显著提高其脾脏选择性[124]。总的来说，略大于200 nm的尺寸、阴离子表面和亲水修饰是脾脏靶向的正确性质，而靶向脾脏APCs的配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏的蓄积。在mRNA疫苗领域，一项开创性的研究已经在动物实验和人体临床试验中证明了全身性mRNA疫苗对癌症的有效性[62]。该研究通过改变mRNA与阳离子脂质体的混合比例制备不同表面电荷的脂质体，在小鼠全身性给药后，根据其mRNA在脾脏中的传递效率进行筛选。在一项研究中，用mRNA与阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，可以有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，并表达蛋白质。该系统在几种小鼠癌症模型中证明了治疗的有效性，并在人类中诱导了可检测水平的抗原特异性T细胞。随后的临床试验表明，该系统靶向肿瘤相关抗原[8]和新抗原[9]，具有强大的抗肿瘤作用。人体氟-2-脱氧-2-d -葡萄糖正电子发射断层扫描(FDG-PET)显示，在输送这种阴离子脂质复合物后，脾脏选择性地增加了葡萄糖摄取(图11)[190]，表明该系统在人体中也成功靶向脾脏。这一临床成功促进了针对脾脏的mRNA递送系统的发展。例如，在mRNA-iLNP中加入阴离子脂质可使iLNP从肝脏重定向到脾脏，而iLNP对肝脏具有内在的趋向性[191]。随后的一项机制研究表明，阴离子脂质的加入改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白冠的成分，这决定了iLNP的组织趋向性[171]。同样，小鼠静脉注射后，含有报告基因mRNA和多阳离子的多聚复合物选择性地在脾脏和淋巴结中表达报告蛋白(图12(a))[125]。该多阳离子具有两性离子结构，带负电荷的磷酸基团加在阳离子侧链上。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效表达报告蛋白(图12(b))。虽然阴离子纳米颗粒在mRNA疫苗接种中经常被用于靶向脾脏[62,110]，但一种两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也表现出选择性的将mRNA递送到脾脏[126]。将疏水烷基链与聚胺基纳米颗粒偶联制备碳点。通过体外筛选对全身注射两种碳点配方的体内功能进行了评估。其中一种向脾脏选择性递送mRNA，在癌症疫苗中诱导有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学特性靶向脾脏。然而，大多数系统的靶向机制尚不清楚，阐明这些机制将有助于未来脾脏靶向系统的合理设计。伴随着依赖于物理化学性质方法的发展，基于配体的系统也能实现细胞水平的精确靶向。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚物上，将mRNA递送脾树突状细胞的效率提高了4倍[127]。在针对肿瘤相关抗原的肿瘤疫苗中，脂质复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂质多聚物可以诱导蛋白在脾脏以外的器官表达，包括肝脏。为了提高对脾树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖代替单甘露糖作为配体[128]。结果，三甘露糖脂复合物特异性地将mRNA递送至脾脏，而在其他器官中递送的mRNA蛋白表达很少。此外,在小鼠脾脏中，CD11c+ apc耗尽后，该蛋白的表达急剧降低，表明该系统对脾脏apc中具有高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应与I型IFN无关，因此即使在1 mΨ修饰后也能保持CTL活性。因此，包裹1 mΨ-修饰 mRNA的脂质聚合物提供了癌症疫苗有效性，并且诱导全身性细胞因子释放最少。另一组使用唾液酸靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (siglec1)作为iLNP的配体[192]。有趣的是，将唾液酸引入iLNP可显著提高内体逃逸效率。因此，在系统性给药后，iLNP有效的mRNA递送到脾树突状细胞，增强了疫苗的抗癌性。粘膜疫苗可以避免侵入性注射步骤，并在粘膜相关淋巴组织(MALT)中触发强大的局部和全身免疫反应[193]。特别是包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道粘膜，是针对传染性呼吸道疾病疫苗的吸引力部位[194]。在临床试验中，鼻内给药或吸入抗COVID-19减毒活疫苗和腺病毒载体粘膜疫苗表现出良好的结果[195]。在粘膜免疫中，分泌到黏液中的IgA在外源病原体的首次侵入中和及清除发挥重要作用，有效地预防了感染。此外，免疫接种可有效诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫[196,197]。这一特性对于预防高突变率病毒(如RNA病毒)的感染极具吸引力。有效诱导IgA的分泌需要抗原递送到位于粘液覆盖的上皮屏障下淋巴组织中的apc。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面进入固有层[198]。因此，之前关于免疫接种的研究试图促进疫苗通过黏液渗透，使其被M细胞摄取，证明了这一策略的可行性[199]。在这种给药途径中，靶向apc也很关键，其中apc激活的B细胞在活化的CD4+ T细胞的帮助下大量分泌IgA[200]。值得注意的是，不同部位的粘膜存在串扰。因此，在粘膜部位接种疫苗可以诱导远端粘膜部位的抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的防御[201]。除了粘膜IgA分泌外，活化的B细胞还提供全身IgG分泌以达到全身免疫[202]。此外，粘膜接种可诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，促进了其在癌症疫苗中的应用[129]虽然粘膜疫苗有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报道涉及这一主题。在先前针对流感病毒和SARS-CoV-2疫苗的研究中，与静脉给药相比，粘膜给药saRNA-iLNP导致抗体滴度降低10倍以上，同时细胞免疫效率降低[91]。机制分析显示，粘膜给药后血清细胞因子水平高于静脉给药。因此，作者通过低佐剂性解释疫苗接种效率的降低。随后的一项研究使用4种不同的疫苗配方:固体LNP、聚合纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP，更全面地比较了saRNA疫苗的粘膜、肌肉和皮内接种[175]。在每种配方中，即使粘膜接种采用的mRNA剂量比其他两种途径高10倍，粘膜接种产生的体液和细胞免疫效率始终低于其他接种途径。荧光素酶mRNA报告基因分析显示，粘膜给药后荧光素酶的表达仅持续几天，而注射后荧光素酶的表达持续时间超过10天。因此，注射saRNA引起的细胞快速清除解释了注射saRNA疫苗的低免疫原性。与此同时，一些报告显示利用脂质和聚合物为基础的系统，在mRNA疫苗接种方面取得了可喜的结果。在脂质系统的背景下，一项开创性的研究采用商业脂质试剂包裹mRNA，在小鼠模型中通过预防性和治疗性给药诱导抗癌活性[130]。在另一项研究中，用鱼精蛋白缩合后将mRNA装载到聚乙二醇化的阳离子脂质体中[131]。该系统在培养细胞中有效的表达抗原和刺激免疫，并在小鼠中具有抗肿瘤活性，同时有效诱导CD4+和CD8+ T细胞。在最近的一项研究中，使用阳离子脂质取代两性离子辅助脂质的iLNP用于免疫接种，提高了mRNA向粘膜组织的递送效率[76]。由此产生的iLNP有效的将mRNA递送至粘膜。最终，当装载编码SARS CoV-2刺突蛋白受体结合域融合蛋白和补体C3蛋白的mRNA时，iLNP强大的系统性诱导IgG，其水平与使用相同系统接种相当。在聚合物系统领域，一系列研究尝试克服阻碍mRNA疫苗到达apc的鼻上皮屏障。虽然多阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地打破了屏障，但它们可以诱导组织损伤。因此，这些研究用环糊精修饰PEI，通过降低电荷密度来减轻细胞毒性。接种疫苗后，由此产生的复合体成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞[132]。随后的一项机制研究表明，该复合蛋白可有效地在颈部浅淋巴结、颈部深淋巴结和腋窝淋巴结中表达蛋白，并激活淋巴结中的树突状细胞，从而提高疫苗接种效率[133]。在安全性分析中，多聚复合物不会引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中也未观察到异常。在最近的一项研究中，试图通过将聚乙二醇化的mRNA复合物递送到肺部接种粘膜疫苗[203]。对于肺动脉输送，表面PEG的密度需要优化[204]。尽管其表面致密的PEG层阻碍其进入靶细胞，但PEG减轻了阳离子多聚物引起的组织损伤并促进其粘膜渗透。该疫苗首先通过筛选基于肺递送效率的PEG密度和多阳离子结构进行优化。最佳复合体在肺APCs和上皮细胞中高效表达蛋白。在使用SARS-CoV-2疫苗的情况下，复合体成功诱导了引流淋巴结中的抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和粘膜分泌IgG，表明成功诱导了粘膜免疫。最终该系统有效地保护小鼠免受病毒攻击。然而，该系统未能诱导出可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNA酶攻击，靶向APC和淋巴组织，具有最小的脱靶分布，以及先天免疫激活的时间和空间控制。虽然刺激先天免疫对于疫苗有效性至关重要，但过度佐剂可导致不良反应并阻碍疫苗效果。在mRNA传递系统的背景下，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布于非靶组织，如肝脏和心脏，可导致罕见但严重的不良反应[12,116]。微调mRNA疫苗中的这些不同因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最佳mRNA疫苗的设计。例如，根据在小鼠和NHPs中的抗原产生能力，从30种LNPs配方中选择了获批的COVID-19疫苗mRNA-1273中使用的可电离脂质SM-102[90]。值得注意的是，电离脂质结构的微小变化会导致体液免疫诱导的实质性差异，而pKa在6.6和6.9之间的电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种LNPs在小鼠中表现出相当的抗体产生效率，但它们在NHPs中诱导抗体存在巨大差异，凸显了疫苗效果的物种特异性。更详细地解读结构-功能关系可能有利于未来的疫苗开发，为此需要像本综述正在进行强有力的机制分析。上述物种差异是整个纳米医学领域的一个关键问题。例如，纳米药物在临床前动物模型和人类之间的生物分布存在显著差异[205]。吸附在纳米药物上的蛋白质冠的物种特异性变化通过影响克服几种生物障碍的过程，改变纳米药物在每个物种中的分布，例如有限的组织扩散和不良的清除机制。此外，对mRNA疫苗构成额外阻碍的促炎反应也因物种而异。例如，小鼠对阴离子mRNA脂聚物耐受性比人类更强，全身注射后表现出较小的促炎反应[61]。与人类相比，小鼠在促炎刺激下更有效地产生抗炎IL-1ra，减轻了mRNA疫苗的全身反应性。解决物种差异对未来的疫苗开发至关重要。目前的mRNA疫苗尽管在应对抗COVID-19方面取得了成功，但仍需改进，特别是在降低反应原性方面。虽然在大流行期间，少数剂量的反应原性被认为是可以接受的，但仍需要具有较温和反应原性的mRNA疫苗配方，以反复增强对COVID-19的免疫，并在其他传染病中广泛应用。此外，强反应原性也是疫苗探讨的点[206]。关于反应原性和免疫原性(疫苗效应)是否可分离的争论仍在继续[30]。在人体中，第二剂疫苗接种后的全身性反应性比第一剂疫苗接种后的全身性反应性更为常见[3,4]，这表明适应性免疫参与了反应性。此外，在人类和小鼠中，第二次给药后，反应原性的增强与更高水平的全身IFN-γ分泌相一致[20,29]。在一项小鼠研究中，是第二剂量后产生的IFN-γ主要来自CD4+和CD8+ T细胞，而IFN-γ受体中和抗体的使用抑制了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的活化。这些发现表面了反应原性和免疫原性之间的密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响最小。此外，全身反应原性的强度与人体体液和细胞免疫诱导效果的相关性不大[207,208]。这些结果表明了分离反应原性和免疫原性的潜力。在佐剂性方面，阐明反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路有助于开发降低反应原性的有效疫苗。在淋巴结中有效积累的mRNA递送系统具有最小的全身泄漏[10,55,168]，在保持有效性的同时减轻全身不良反应。虽然本综述重点关注佐剂性和mRNA递送系统，但与其他策略的结合对于mRNA疫苗的未来设计至关重要。旨在延长抗原表达时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。在一项3期临床试验中，saRNA疫苗ARCT-154在两次接种BNT162b2或mRNA-1273后，作为加强疫苗，其免疫原性比BNT162b2强[209]。编码SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫应答，尽管环状RNA和线性mRNA的疫苗有效性几乎相当[210]。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学极大地影响疫苗效果，持续暴露导致抗体产生增强[211,212]。因此，调节mRNA疫苗的动力学可以提高疫苗的效力。为了实现这一点，一些研究尝试控制mRNA纳米颗粒从水凝胶的释放。例如，将mRNA与基于脂质的商业试剂络合，装载到基于聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)的多孔支架上[213]。皮下注射后，该支架保留mRNA超过3天，与直接注射mRNA相比，蛋白质表达效率提高。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性PEI (LPEI)负载抗原mRNA和TLR7激动剂的水凝胶[214]。水凝胶在小鼠体内注射一个月后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，同时在此期间保护mRNA不被降解。结果表明，水凝胶注射比纳米颗粒注射具有更好的抗肿瘤效果。mRNA编码蛋白的工程化也显著影响疫苗的有效性。有趣的是，在mRNA疫苗中设计SARS-CoV-2的刺突蛋白以形成病毒样颗粒，可使中和效价提高10倍以上[215]。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的联合至关重要[7]。优化佐剂和递送系统，结合上述其他策略，将在未来极大地提高mRNA疫苗的潜力。参考文献：Mochida Y, Uchida S. mRNA vaccine designs for optimal adjuvanticity and delivery. RNA Biol. 2024 Jan;21(1):1-27. doi: 10.1080/15476286.2024.2333123. Epub 2024 Mar 26. PMID: 38528828; PMCID: PMC10968337.
