血清miRNA-146、LPS、ROS在早期妊娠胚胎丢失患者中的水平及临床意义

选取2021年3月至2023年3月广东省东莞市妇幼保健院收治的100例EPEL患者作为研究组,另外选取同期在广东省东莞市妇幼保健院就诊的100例正常妊娠女性作为对照组,检测并比较研究组和对照组血清指标水平。培养HTR-8/SVneo细胞,按照不同转染方式分成miRNA-146抑制剂组、miRNA-146模拟物组及NC组。比较miRNA-146抑制剂组、miRNA-146模拟物组Toll样受体4(TLR4)蛋白和核因子-κB(NF-κB)蛋白水平,比较NC组、miRNA-146模拟物组和miRNA-146抑制剂组miRNA-146水平及HTR-8/SVneo细胞的凋亡率,比较不同水平 LPS处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力。采用Pearson相关分析EPEL患者miRNA-146水平与ROS、LPS、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TLR4蛋白和NF-κB蛋白水平的相关性。

研究组和对照组血清指标水平比较： 

研究组LPS、ROS、IL-6和TNF-α水平高于对照组,且E2、孕酮、miRNA-146水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

 miRNA-146模拟物组和miRNA-146抑制剂组及NC组miRNA-146水平比较,差异有统计学意义(F=26.68,P<0.05)。miRNA-146模拟物组miRNA-146水平(6.87±1.59)高于miRNA-146抑制剂组(1.33±0.48)和NC组(3.07±1.12),差异均有统计学意义(t=5.28、3.39,P<0.05)。

不同水平 LPS处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力比较：

MTT比色法结果显示,不同水平LPS(8、12、16、20 μg/mL) 处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力分别为(58.48±11.37)、(40.63±8.49)、(23.48±4.36)、(7.75±1.83),而20 μg/mL LPS+miRNA-146模拟物处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力为(82.94±22.74)。不同水平LPS处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力比较,差异有统计学意义(F=39.05,P<0.05)。20 μg/mL LPS+miRNA-146模拟物处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力高于8、12、16、20 μg/mL LPS处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力(t=6.07、9.24、12.54、19.85,P<0.05)。

NC组、miRNA-146模拟物组和miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞的凋亡率比较：

NC组、miRNA-146模拟物组和miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞的凋亡率比较,差异有统计学意义(F=129.47,P<0.05)。miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞的凋亡率[(81.52±18.46)%]高于NC组[(18.46±5.19)%]和miRNA-146模拟物组[(4.69±1.43 )%],且NC组高于miRNA-146模拟物组,差异均有统计学意义(t=6.84、10.57、23.83,P<0.05)。

miRNA-146模拟物组和miRNA-146抑制剂组TLR4蛋白和NF-κB蛋白水平比较：

miRNA-146模拟物组TLR4蛋白(35.82±9.78)、NF-κB蛋白(21.14±4.66 )水平分别低于miRNA-146抑制剂组TLR4蛋白(93.45± 18.34)、NF-κB蛋白(62.57±14.18)水平,差异均有统计学意义(t=47.35、28.46,P<0.05)。见图1。

图1 HTR-8/SVneo细胞中TLR4蛋白和NF-κB蛋白的表达

EPEL患者miRNA-146水平与ROS、LPS、IL-6、TNF-α、TLR4蛋白和NF-κB蛋白水平的相关性分析：

Pearson相关分析结果显示,EPEL患者miRNA-146水平与ROS、LPS、IL-6、TNF-α、TLR4蛋白和NF-κB蛋白水平呈负相关(r=-0.737、-0.614、-0.712、-0.729、-0.739、-0.708,P<0.05)。

母体胎盘免疫功能对胎儿的精细免疫调控是保障妊娠正常进行的必要条件,在这个过程中,任何影响母-胎界面微环境的因素都有可能导致母胎免疫耐受失衡,最终发生EPEL等不良妊娠结局。最新研究表明,细菌定植胎盘导致EPEL与以往认为子宫是无菌环境的观点有所不同。已知50%以上的EPEL是由子宫内感染引起的,所以病原微生物及代谢产物作为极其重要的致病因子诱导、破坏母胎的免疫耐受平衡。目前胎盘病原菌的来源尚未清楚,可能与阴道上行感染、胎盘垂直传播及血液感染有关。LPS是革兰阴性菌的主要成分,但是作为非特异性免疫抗原,当进入机体微循环后与宿主效应细胞(主要为单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)相互作用,分泌TNF-α、IL-6、ROS、一氧化氮(NO)等生物活性分子,使机体内环境处于紊乱状态,引起内毒素血症、脓毒血症、生殖系统炎症等。OHTSUA 等研究发现LPS在小鼠巨噬细胞中促进IL-6分泌,可能是通过激活 TLR4/NF-κB信号通路产生ROS,造成妊娠期免疫反应,从而影响母胎免疫耐受平衡,导致EPEL,提示LPS参与 EPEL发生、发展的病理过程。

本研究采用miRNA-146模拟物或miRNA-146抑制剂转染HTR-8/SVneo细胞,然后分别评估了不同水平 LPS处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力,以及NC组、miRNA-146模拟物组及miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞的凋亡率。结果显示,不同水平LPS(8、12、16、20 μg/mL) 处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力低于20 μg/mL LPS+miRNA-146模拟物处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力。这提示上调miRNA-146的水平对LPS损伤的HTR-8/SVneo细胞具有保护作用,其机制是miRNA-146上调LPS诱导抑制TLR4/NF-κB信号通路,体现出TLR4/NF-κB信号通路在生殖细胞增殖、分化和生长中发挥重要作用。miRNA-146模拟物组HTR-8/SVneo细胞的凋亡率明显低于NC组和miRNA-146抑制剂组,提示miRNA-146具有抗炎症和抗凋亡的作用。有研究表明,miRNA在M1巨噬细胞和滋养层细胞之间的通讯中起到重要作用,M1巨噬细胞是母-胎界面的重要免疫细胞,可以抑制滋养层细胞的上皮-间质转化,揭示了miRNA通过影响M1巨噬细胞调节滋养层的潜在机制。但是目前尚不明确miRNA-146负性调控LPS/TLR4/NF-κB信号通路是否参与了HTR-8/SVneo细胞增殖、生长和凋亡过程。

本研究还发现,研究组LPS、ROS、IL-6和TNF-α水平高于对照组,且E2、孕酮、miRNA-146水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时本研究结果显示,miRNA-146模拟物组TLR4蛋白、NF-κB蛋白水平低于miRNA-146抑制剂组,差异均有统计学意义(P<0.05)。该结果与文献的研究结果趋势一致,从临床血清标本的角度佐证了细胞层面的研究。笔者认为,EPEL患者由于LPS水平升高,以及雌激素、孕激素水平紊乱,促使机体产生过多的ROS,诱发母-胎界面氧化应激和炎症反应。同时,LPS会刺激生成大量ROS,加重母-胎界面氧化应激和氧化损伤。本课题组前期研究证实,在雌激素水平紊乱的情况下,LPS会刺激机体产生大量ROS,从而加重氧化应激和卵泡细胞的损伤。WANG等研究表明LPS上调NF-κB蛋白和NO的水平,增加睾丸炎症负荷,诱导的睾丸产生ROS,导致生殖细胞增殖率和存活率下降,最终导致生殖细胞凋亡。本研究结果显示,miRNA-146水平与LPS、ROS水平呈负相关(P<0.05),提示下调miRNA-146负性调控TLR4/NF-κB信号通路诱导LPS和ROS水平升高,导致母-胎界面发生氧化应激反应、炎症反应,诱导胎盘血管内皮功能紊乱,使胎盘血流下降而缺血、缺氧,最终导致EPEL发生。本研究结果显示,通过上调miRNA-146激活TLR4/NF-κB信号通路促进HTR-8/SVneo细胞生长,其作用机制可能为绕过下丘脑-垂体-卵巢轴对早期丢失胚胎发挥胎盘保护作用。最后,本研究还探讨了miRNA-146与炎症因子IL-6和TNF-α的关系,miRNA-146水平与IL-6和TNF-α水平呈负相关(P<0.05),由此可见miRNA-146可能对母-胎界面的炎症反应具有一定的调控作用,可能是miRNA-146通过LPS/ROS/NF-κB信号通路发挥调控作用,使得IL-6和TNF-α的水平下降,其作用机制可能与下游的炎症因子释放有密切关联。

综上所述,本研究提出miRNA-146负性调控LPS和ROS,并参与EPEL发生、发展过程。在本研究中,EPEL患者miRNA-146水平与LPS、ROS、IL-6、TNF-α水平呈负相关,可能是下调miRNA-146诱导LPS和ROS通过调控 TLR4/NF-κB信号通路使母-胎界面发生氧化应激和炎症反应,导致发生EPEL。本研究结果显示,调节miRNA-146可能是预防和治疗EPEL的一个新靶点。

（参考文献略）