基于M2e的流感疫苗与核蛋白
健康
2024-09-15 00:00
湖北
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摘要：发现通用流感疫苗的保守抗原需要解决目前许可的流感疫苗相关的一系列问题，例如年度重新配方和与流行亚型的不匹配。后者导致疫苗效力低下，因此导致易感和免疫受损个体中严重的疾病并发症和高住院率。通用流感疫苗由于存在在大多数（如果不是全部）流感类型和亚型中发现的保守表位，因此能够确保对所有流感亚型提供交叉保护，例如流感基质蛋白2外域（M2e）和核蛋白（NP）。尽管流感M2e的免疫原性相对较低，但已被证明能在人类接受者中诱导体液反应。另一方面，流感NP促进了显著的抗流感T细胞反应。此外，NP亚基能够组装成颗粒，这些颗粒可以进一步作为M2e肽的佐剂载体。实际上，当NP与M2e融合并在异源宿主（如大肠杆菌）中表达时，可以将NP的T细胞免疫优势转移到M2e，而不会损害其抗原性。鉴于NP-M2e融合蛋白在诱导交叉保护性抗流感细胞介导和体液免疫方面的潜力，因此值得进一步探索其作为通用流感疫苗的可能性。![]()
流感A病毒（IAVs）是感染各种鸟类和哺乳动物的医学上最重要的呼吸道病原体之一。尽管有流感疫苗可用，IAVs仍然在全球范围内引起高发病率和死亡率，特别是在季节性流感爆发和流感大流行期间。每年，由IAVs引起的季节性流感大约导致全球300万至500万例严重呼吸道疾病和25万至50万人死亡。流感病毒分为四种主要类型：A、B、C和D。它们是带有6-8个单链负义RNA基因组段的包膜病毒，形成Orthomyxoviridae家族的成员。在流感病毒中，IAVs是唯一可以根据病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原进一步分类为亚型的类型。到目前为止，已经鉴定出18个HA亚型和11个NA亚型。H1-H3和N1-N2亚型已经感染并在人类群体中传播，其中H1N1和H3N2目前是共同循环的亚型。同样，流感B（IBVs）和C病毒也感染人类，但它们不像IAVs那样形成多个亚型；IBVs可以分为两个抗原性不同的谱系，即山形和维多利亚谱系。自1983年以来，两个IBVs谱系一直在人类群体中共循环。由于IAVs和IBVs不断存在于人类群体中，它们一直是年度流感爆发的主要贡献者。流感C病毒通常在人类中引起轻微的流感，而流感D病毒则不知道会引起人类感染。正如在许多传染病中所证明的那样，流感疫苗刺激了对流感感染的主动获得性免疫，特别是在6个月以上且没有禁忌症的个体中。然而，疫苗效力常常被流感RNA基因组的高突变率所规避，这导致通过抗原漂移和抗原转移形成新的IAV株。通过这些基因突变事件，新出现的IAV株能够逃避疫苗接种所诱导的预先存在的免疫力。抗原漂移和转移都改变了HA和NA糖蛋白的抗原性，而不影响它们的生物学功能和蛋白质构象。在抗原漂移期间，通过免疫选择压力选择引入IAV RNA基因组的随机突变，如核苷酸替换、缺失和插入，这导致病毒表面蛋白，即HA和NA的抗原变化。这减弱了流感疫苗的预防效果，因为这两种病毒抗原构成了疫苗配方中的主要抗原成分。另一方面，抗原转移涉及两个或更多不同IAV亚型在同一个宿主中感染的基因重组；基因重排最终导致表面糖蛋白的剧烈变化，因此改变了抗原性。令人担忧的是，当抗原转移发生在来自不同宿主物种的IAV株之间时，例如禽类和人类IAV株，它可能促进一个全新的IAV亚型的形成，这可能会引起流感大流行。新的流感株在抗原上与循环的流感亚型不同。因此，它降低了目前使用的流感疫苗的效力。此外，新的流感亚型被发现在人类中适应得很好，正如2009年由一种新的猪源H1N1亚型引起的最近一次流感大流行所观察到的。与感染H1N1pdm09的年轻人和老年人相比，前者的死亡率更高，包括那些本来健康的。人们认为，65岁及以上的老年人可能从以前接触过的H1N1所触发的预先存在的免疫力中获得某种程度的交叉保护。然而，孕妇、儿童以及有慢性肺部疾病、基础疾病和免疫受损状况的个体仍然有更高风险遭受严重感染结果，特别是细菌性肺炎。总之，流感疫苗接种仍然是避免季节性和大流行性流感以及避免流感相关严重并发症的最有效预防措施，特别是在高度脆弱的个体中。到目前为止，已经记录了四次严重的流感大流行，分别是1918年西班牙流感（H1N1）、1957年亚洲流感（H2N2）、1968年香港流感（H3N2）和2009年猪源流感（H1N1）。这些大流行的病原体表明IAVs与流感大流行有很强的关联，因此是对全球社区的主要公共卫生威胁。在四次报告的流感大流行中，1918年流感大流行被认为是历史上最严重的传染病爆发。据报道，许多患者患有急性和严重的肺出血和水肿。严重的呼吸道疾病导致约5000万人死亡。一些研究努力检查1918年大流行IAV H1N1的基因组，但没有得出关于宿主作为感染源的结论性发现。1918年IAV H1N1的基因组与迄今为止发现的任何禽类或哺乳动物IAVs不同，其RNA基因组通过随机、沉默的核苷酸变化而改变。1918年H1N1的基因组最有可能通过在禽类宿主中的广泛基因适应从禽流感病毒进化而来，然后溢出到人类宿主。大约四十年后，第二次流感大流行在1957年袭击了世界人口。大流行是由一种新的IAV亚型（H2N2）引起的，该亚型是通过人类IAV H1N1和禽IAV H2N2之间的基因重组而出现的。大流行导致100万人死亡。大约十年后，在1968年，人类IAV H2N2和禽H3亚型之间的基因重组导致了一种新的IAV亚型，即H3N2。新的IAV H3N2在抗原上与先前确定的大流行IAVs不同。在这种情况下，由于缺乏对新流感亚型的预先存在的免疫力，病毒具有显著的传染性，能够迅速传播，最终导致流感大流行。在1968年香港流感中，全球约有100万人死亡，其中65岁及以上的老年人是受影响最严重的群体。2009年，由H1N1pdm09引起的第四次流感大流行导致18631例实验室确认的死亡。遗传和流行病学证据表明，第一次在墨西哥发生的pdmH1N1爆发是由于H1N1的伪抗原转移，其中H1和H2之间的差异被证明是40-46%。由于遗传变异，H1N1株进化成一种新的流感病毒亚型（H1N1pdm09）。新的H1N1pdm09病毒与循环的H1N1株和季节性流感疫苗因此无法提供有效的保护，以防止病毒感染。北美三重重组H1N2和欧亚猪流感H1N1之间的抗原转移导致了新的H1N1pdm09作为四重重组体的出现。在H1N1pdm09的八个病毒RNA片段中，PB2、PB1、PA、NP、HA和NS基因与H1N2密切相关。北美H1N2亚型是通过猪中两次单独的抗原转移形成的，并于1999年被检测到。它是三重重组猪H3N2（PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS）和经典猪H1N1（HA）之间的基因重组产物。另一方面，H1N1pdm09的NA和MP基因片段则来自禽类样欧亚猪H1N1。根据的基因组分析结果，欧亚猪H1N1也是通过至少两次基因重组事件形成的，其中NA和MP基因分别于1992年和1997年来自禽类宿主。当这两种重组产物在猪中重新组合它们的遗传物质时，一种新的流感A亚型最终出现，并被命名为H1N1pdm09。除了流感大流行，每年全球都会报告季节性流感爆发。在这些年度流行期间，发病率和死亡率最高的是65岁及以上的老年人、2岁及以下的儿童，以及患有潜在慢性疾病、使他们面临流感并发症风险增加的个体。在这种情况下，流感疫苗接种被认为是在所有年龄组中对抗病毒感染的最有效方式。目前，商业上可用的流感疫苗类型包括减毒活流感疫苗（LAIV）、灭活流感疫苗和重组HA四价疫苗（例如，Flublok Quadrivalent）（表1）。LAIV包括减毒的流感亚型（IAV H1N1和H3N2，IBV山形和IBV维多利亚）对人类健康的风险非常小。这些病毒被操纵以适应相对较冷的温度（大约25°C），因此，当通过鼻内注射到人体时，它们在人体体温下的复制能力很差。普遍认为，与灭活疫苗相比，LAIV能够提供更显著的免疫保护。由于它们在接种者体内复制能力差且暂时，LAIV是有效的T细胞反应激活剂，进而促进体液和细胞介导免疫的激活（表1）。然而，尽管这些减毒流感病毒对健康个体无害且安全，但它们仍可能在免疫受损的人中引起严重并发症和副作用，特别是那些患有慢性疾病的人。在这种情况下，建议2岁及以上的人接种LAIV（表1）。在灭活流感疫苗的配方中，疫苗大多包含被洗涤剂或溶剂破坏的流感病毒、全灭活病毒或纯化的HA和NA亚基（表1）。到目前为止，季节性灭活四价疫苗适用于所有6个月及以上且无禁忌症的人。尽管灭活疫苗的使用推荐给更广泛的年龄范围，但其效力通常低于LAIV。它们主要刺激体液（抗体）反应，因此对流感病毒感染的免疫保护较低（表1）。自2016年以来，食品药品监督管理局（FDA）推荐使用一种名为Flublok Quadrivalent的重组流感亚单位疫苗，用于18岁及以上的成人（表1）。其配方包含来自循环H1N1和H3N2的四种HA，以及两个流感B谱系。HA抗原是使用Sf9昆虫细胞系重组生产的。Flublok Quadrivalent中每种HA抗原的数量是标准灭活流感疫苗的三倍（45微克对15微克）。人们认为，更高的HA含量是对抗流感病毒感染的交叉保护、更持久和改善免疫原性的因素。以前的临床试验证明，Flublok Quadrivalent是安全的，并且在接种的个体中没有导致不良事件。Woo和Moro支持了这一有希望的安全性概况，其中95%的接种后过敏和过敏性反应被发现是不严重的。建议过敏体质是报告事件的原因。因此，这并不特别意味着Flublok Quadrivalent是过敏性的。几项研究表明，流感疫苗可以为不同人群提供保护，包括儿童、健康成人和老年人。一般来说，建议老年人或老年人接种高剂量三价灭活流感疫苗（TIV）（Sanofi Pasteur Fluzone®（60微克×3种菌株））或标准剂量的TIV（Fluad）带有MF59佐剂。MF59是一种水包油的角鲨烯油乳剂，有助于提高接种者的免疫反应。总之，高剂量和标准剂量佐剂疫苗都旨在增强老年人的保护性免疫，因为大约90%的流感相关死亡涉及老年人，尤其是在流感流行期间。在几项研究中，65岁及以上的老年人在接受灭活、裂解病毒流感疫苗后产生的抗体滴度低于健康年轻成人。因此，即使他们之前已经接种过疫苗，也强烈鼓励老年人每年接种流感疫苗，因为他们比其他人群更容易感染流感。对流感疫苗的较低免疫反应可能意味着老年人因流感相关疾病（如肺炎）而有更高的严重并发症风险、更高的住院率和死亡率，因此每年流感疫苗接种的重要性。目前许可的流感疫苗针对流感病毒的主要表面抗原，包括高度可变的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。鉴于流感RNA聚合酶的错误倾向，当前流感疫苗生产的主要挑战之一是HA和NA抗原的不可预测的抗原变化。每年，根据即将流行的主要循环IAV株，都会重新审视流感疫苗配方。因此，流感疫苗的生产通常需要很长时间，至少需要6个月的时间来确定主要循环流感亚型，以便将疫苗分发给公众使用。在这段时间里，最初预测将在下一次流行中占主导地位的病毒亚型可能会经历抗原漂移并在其基因组中引入点突变。这可能导致疫苗与后来循环的IAV亚型不匹配。最终，随着循环流感亚型未能满足预测，流感疫苗的效力下降。这一现象在美国2014-2015年的流感爆发期间很明显。当时，大约80%的循环H3N2分离株在抗原和遗传上与用于制定2014-15年北半球流感疫苗的A/Texas/50/2012（TX/12）株不同。疫苗的有效性估计仅为20%左右。因此，由于对病毒感染的免疫力差，导致65岁以上的人死亡率和发病率高。为了更有效地克服上述挑战，迫切需要包含单一或多个能够诱导对所有或大多数流感病毒具有广泛、交叉反应性免疫的流感病毒抗原成分的新疫苗候选物。最近，流感疫苗开发已将其重点转向创建理想的通用流感疫苗，该疫苗可以对大多数IAV株提供保护，如果不是全部的话，因此省略了每年重新制定流感疫苗的需要。在流感抗原中，基质蛋白2的外域（M2e），在所有IAVs中都是保守的，已经得到了广泛的研究。保守的M2e是流感表面抗原的一部分，它分布在病毒颗粒的表面，但被HA和NA抗原所遮挡。这一特性使M2e较少暴露于流感特异性抗体，因此它不太容易发生抗原变化，更加保守。流感基质蛋白2（M2）是一种内膜病毒蛋白，它在流感病毒复制过程中发挥着重要作用。M2由96个氨基酸组成，包括一个N端外域（M2e）、一个跨膜域和一个细胞质域。在IAV复制过程中，HA与宿主细胞表面受体结合，随后流感病毒被内吞。在细胞质中，M2蛋白被酸性的内体环境激活，形成离子通道，允许质子泵入病毒内部。病毒内部的酸化作用松散了病毒核糖核蛋白（RNP）与基质蛋白1（M1）的相互作用，随后促进病毒基因组通过膜融合孔迁移到宿主细胞质中，在那里病毒RNA基因组被转录和复制。作为一个保守的表面流感抗原，M2e是流感通用疫苗候选物的潜在选择。对M2e的兴趣归因于其相对较少的数量和隐蔽的位置，这反过来阻止了它与抗体的结合，与其它更大、更丰富的表面糖蛋白相比，即HA和NA抗原（图1）。通常，流感病毒表面HA与NA抗原不对称分布，比例为HA:NA = 4-5:1，而流感病毒表面只有少数几份M2e。图1. 流感病毒表面的M2离子通道数量较少，它们被邻近的HA和NA糖蛋白所遮挡，因此不易发生抗原变化，更加保守。此外，M2蛋白在感染的宿主细胞表面大量产生并呈现。在BALB/c小鼠和鸡等实验模型中，抗M2e抗体与表面结合的M2e强烈结合，从而抑制病毒复制和从感染细胞的出芽。抗体与M2e蛋白的结合还促进通过补体溶解或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)清除感染的肺上皮细胞。以前的研究证明，用M2e抗原免疫能够提供针对同一宿主的多种IAV株的交叉保护。这是因为M2e的突变率相对较低，疫苗诱导的预先存在的免疫力有效地对抗同源和异源流感毒株。在最近使用含有异源M2e结构域的病毒样颗粒(VLPs)的微针贴片皮肤免疫策略中，发现它能够提供针对人流感H3N2的免疫保护；肺部病毒载量减少，成功预防了实验动物的体重减轻。尽管M2e在流感病毒中保存得很好，但禽流感病毒的M2e与人类IAVs的M2e在几个氨基酸上有所不同。这可能影响基于M2e的疫苗的特异性，从而在IAV挑战研究中提供部分或不完全的保护。为了克服上述问题，结合疫苗设计中的异源M2e结构域，例如，用鞭毛蛋白标记每个人类和禽类M2e的两个副本[Flagellin-2M2e(human)-2M2e(avian)]被发现能够保护BALB/c小鼠免受人类IAVs(H1N1, H3N2)和禽流感病毒(H5N1)的致命挑战。当通过鼻内引入时，疫苗诱导产生结合到显示细胞表面病毒M2e的感染细胞的粘膜IgA，并随后抑制病毒粒子的释放。在另一项研究中，高剂量IAV H1N1初次感染猪只诱导了非常弱的抗M2e IgG反应。这一观察结果意味着M2e的免疫原性较低，因此解释了为什么第一次自然流感感染通常诱导相对较差的M2e特异性抗体反应。六周后，同样的猪再次感染IAV H3N2。再感染后，发现抗M2e IgG的水平增加了10倍以上。在随后的异源IAV病毒挑战后，抗M2e IgG水平的提高支持了旨在增强人类对流感病毒免疫力的初免-加强免疫策略。基本上，在初免-加强免疫策略中，第一剂疫苗在两周后由第二剂疫苗跟随给药（图2）。通过初次免疫激活的免疫细胞（初级记忆）通常是短暂的。在加强阶段，给予第二剂疫苗以增强之前激活的记忆免疫细胞，使接种者对流感病毒产生持久的免疫反应。图2. 初免-加强免疫策略。第一剂疫苗用于激活接种者的免疫力。为了加强接种者的免疫力，第二剂疫苗在第一剂后大约两周给予。这种策略旨在刺激之前激活的记忆免疫细胞，以提供增强的、持久的保护性免疫力。为了利用基于M2e的疫苗增强宿主对流感病毒的免疫力，Kim等人开发了异源重组M2e5x病毒样颗粒（VLPs）。在该研究中，构建了来自人类、猪和禽流感病毒的异源M2e肽串联重复序列。原则上，构建M2e5x VLPs的目的是诱导比自然流感病毒感染更好的保护性M2e特异性免疫。更大的免疫保护是由VLPs上展示的M2e抗原浓度高于自然病毒单位所贡献的。这最终增加了宿主体液免疫反应对VLPs上M2e抗原的识别。此外，M2e5x VLP疫苗接种还促进了CD4+和CD8+ T细胞的激活，这些细胞在清除肺部病毒感染和确保流感病毒挑战后更好地恢复中发挥着重要作用。几项临床研究表明，基于M2e的疫苗对人类是安全且具有免疫原性的。基于M2e的疫苗触发的体液免疫反应负责抗流感效果。这一点在将抗M2e单克隆抗体被动转移到动物模型中表现得很明显，这反过来又保护了动物免受IAV挑战。此外，Ramos等人的研究进一步证明，在实验性挑战的人类志愿者中施用针对M2e的人类单克隆抗体能够减少流感病毒复制和临床症状。考虑到这些证据，它表明M2e蛋白是通用流感疫苗的良好候选物，能够提供针对流感病毒挑战的交叉保护。众所周知，流感M2e肽本身免疫原性较低。通常对其进行编辑和操作以增强抗M2e免疫反应，例如增加肽密度（串联融合多个M2e抗原）、将M2e肽与载体货物（如乙型肝炎病毒核心（HBc）抗原）和脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白复合体（OMPC）融合，或与鞭毛蛋白和霍乱毒素等佐剂联合使用。在这些策略中，在载体上展示M2e被认为是增强M2e免疫原性的高效、稳健和成本效益高的方法。它通常涉及将M2e的编码序列与载体的编码序列融合，随后进行重组蛋白的合成和纯化。有时，在异质肽之间添加短连接链，以维持它们的天然结构或构象。M2e肽和载体蛋白也可以分别合成和纯化，然后通过化学配体连接在一起。在之前的研究中，乙型肝炎核心(HBc)/M2e杂交蛋白在大肠杆菌(E. coli)中以不溶性部分表达。为了使细菌细胞中的HBc/M2e嵌合蛋白溶解。许多先前的研究已经通过遗传操作展示了将M2e肽与HBc抗原融合。融合蛋白自动组装成在其表面展示M2e肽的病毒样颗粒（VLPs）。除了HBc，M2e的串联重复（M2e5x）也被融合到流感病毒HA的跨膜域。重组融合蛋白组装成VLPs并诱导对IAVs的交叉保护。令人惊讶的是，免疫保护水平甚至高于HA疫苗。流感病毒HA的跨膜域作为M2e的佐剂载体的成功表明，可以使用能够组装成颗粒结构的高度保守的IAV蛋白作为M2e肽的载体货物。人们认为载体蛋白的免疫优势（T细胞和B细胞免疫优势表位）可以转移到M2e上，并增加M2e肽的免疫原性。在IAV结构蛋白中，NP被认为是M2e的强大载体候选物。流感病毒NP是一种结构蛋白，它包裹病毒的负义、单链RNA基因组。它对病毒RNA的转录、复制和包装至关重要。当在宿主细胞中合成时，NP亚基形成两种类型的颗粒，即环状结构和长丝状复合物。这些坚固的构象使NP能够稳定地展示M2e肽并增强其免疫原性。5.流感病毒核蛋白（NP）作为M2e融合货物的免疫原性和效力 作为内部结构蛋白，流感病毒NP在病毒演化过程中具有相对较低的突变率。同一流感亚型的多种病毒分离株的NP蛋白具有超过90%的氨基酸同源性。与所有四种流感病毒相比，IAVs和IBVs的NP同源性较低。主要差异在于IBV NP的前69个氨基酸残基与IAVs没有同源性；此外，在IBV NP的N端存在一个50个保守氨基酸的延伸，在IAV NP中不存在。在流感病毒感染期间，NP可能被细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别。氨基酸残基55-69是T辅助（Th）表位，而残基147-158负责CTL反应。这两个表位都受到主要组织相容性复合体（MHC）的限制；相容性越高，对基于NP的流感病毒疫苗引起的免疫反应越大。在感染细胞中，NP被产生，随后在病毒感染细胞的MHC I类分子表面呈现。NP-MHC-I类复合物与CTL上的T细胞受体（TcR）相互作用，从而激活CTL。激活的CTL通过细胞溶解和程序性细胞死亡破坏流感病毒感染的细胞，因此消除病毒感染。由于流感病毒的NP中存在保守表位，CTL交叉反应可以针对不同的流感亚型，并作为控制流感病毒感染的关键因素。CTL交叉反应有助于抑制病毒粒子的释放，控制病毒复制并减少流感相关疾病的严重程度。另一方面，Th表位促进了交叉反应性抗体的产生。交叉反应性抗体与NP的结合扰乱了病毒RNA的转录和基因组包装，最终阻碍了病毒感染过程。值得注意的是，交叉反应性抗体还通过MHC分子与感染细胞表面展示的NP肽结合。结合的抗体随后通过补体依赖性细胞毒性(CDCC)（图3A）或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)（图3B）触发细胞死亡。抗体识别膜锚定的NP，招募补体因子在细胞膜上形成膜攻击复合体并引起细胞溶解（图3A）。就ADCC而言，NK细胞与细胞表面的NP特异性抗体结合，并通过效应分子如穿孔素和颗粒酶诱导细胞死亡（图3B）。存在高滴度的ADCC攻击复合体在细胞膜上形成并引起细胞溶解（图3A）。就ADCC而言，NK细胞与细胞表面的NP特异性抗体结合，并通过效应分子诱导细胞死亡，从而形成对流感病毒的长期记忆。图3. 流感病毒感染细胞中的补体和抗体介导的细胞毒性。(A) 抗体与细胞表面的NP肽结合，招募补体因子在细胞膜上形成膜攻击复合体(MAC)并诱导细胞溶解。(B) 在感染细胞表面，NK细胞与NP特异性抗体结合，并通过穿孔素和颗粒酶诱导细胞死亡。NP亚基组装并寡聚化成颗粒，其氨基端(N-末端)从NP颗粒向外。此外，广泛证明在异源宿主中生产的重组病毒样颗粒(VLPs)不携带遗传物质，因此它们不太可能引起严重的过敏反应和过敏性休克。流感病毒NP已使用不同的表达系统进行重组生产。重组合成的NP颗粒在实验模型中保持了抗原性和免疫原性。总之，这使得流感病毒NP成为一个有趣的抗原载体，用于针对流感病毒的重组预防性疫苗，特别是那些构成威胁的流行性威胁，如H5N1、H9N2或H7N7。通过（i）PCR基因融合，随后生产和纯化重组融合蛋白，或（ii）化学链接技术将M2e肽与NP化学链接，可以实现M2e与NP蛋白的融合。然而，通过化学链接将两个异源蛋白结合在一起可能会向疫苗接种者体内输送更多的外来物质，这可能会导致某些接种者的过敏反应。因此，近年来通过重组DNA技术生产抗原亚单位作为疫苗的趋势在上升。例如，在大肠杆菌表面构建和表达IAVs的非结构1 (NS1)蛋白，以及在HBc VLPs上展示尼帕病毒(NiV) NP的抗原区域。在这些研究中，AIV NS1和NiV NP通过PCR基因融合与其各自的载体连接，并在大肠杆菌表达系统中大量生产。尽管在异源宿主中生产，但病毒抗原在构象和抗原性上保持完整。理论上，通过将M2e编码序列融合到NP编码序列的5'端，可以在NP颗粒上展示M2e肽。在大肠杆菌中表达时，融合基因被翻译成一种嵌合蛋白，其中M2e肽存在于NP的N-末端。预期合成的融合M2e-NP蛋白将寡聚化为在颗粒外部展示多个M2e副本的NP颗粒。由于其快速生长速度和低成本底物的高产出等显著优势，细菌表达系统（例如大肠杆菌表达系统）在许多重组蛋白应用中比其他替代方案（如昆虫、哺乳动物和酵母表达系统）更受青睐。直到最近，已经在大肠杆菌中生产了各种重组蛋白、肽和疫苗，因为它涉及的流程不那么繁琐和劳动密集，成本效益高但流程稳健。当多个M2e-NP亚基组装并寡聚化为颗粒时，疫苗中存在的M2e肽的总数增加，这增强了M2e的抗原性和免疫原性。此外，NP激活CD8+ T细胞、Th和体液反应的能力也转移到了M2e上。总的来说，嵌合M2e-NP蛋白可以刺激更强的体液和细胞介导的反应，从而提供更广泛、持久的保护，以抵御各种流感病毒株。疫苗诱导的记忆CD8+ T细胞在最小化流感病毒复制方面的重要性已经得到了实证。疫苗接种者表现出较轻的症状和显著改善的临床结果。在其他动物模型和用流感H1N1、H7N7、H3N2和H5N1病毒挑战的人类受试者中，也记录了描述记忆CD8+ T细胞保护作用的类似观察结果。除了重组蛋白方法外，使用病毒载体传递基于M2e和/或NP的DNA疫苗的方法也在其他地方描述。DNA疫苗在受体中诱导针对流感的保护性免疫。将NP和M2 DNA与腺病毒骨架一起传递，保护了用致命病毒剂量挑战的小鼠。因此，这加强了NP和M2蛋白同时诱导的保护优于单一蛋白或抗原诱导的保护的观点。然而，DNA疫苗的使用因其复杂的免疫过程和产生DNA和载体特异性抗体而受到限制。抗载体抗体可能会干扰免疫结果。此外，由于异源DNA分子整合导致的染色体DNA突变的安全问题仍然存在争议；因此，DNA疫苗的应用需要严格的实证证据来验证其安全概况和效力。由于DNA疫苗的安全问题，可以尝试使用另一种核酸疫苗，即mRNA疫苗。最近，mRNA疫苗已被用来预防并在全球范围内产生针对SARS冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染的群体免疫。使用mRNA疫苗预防冠状病毒病 (COVID-19)基于以下优势：(1)更短的生产时间，(2)相对容易修改编码抗原，(3)安全性，(4)能够刺激细胞和体液免疫。考虑到这些优势，利用编码免疫原性抗原的mRNA分子作为预防流感的潜在疫苗候选物可能是一个有希望的方法。将重组M2e-NP融合蛋白给受试者接种，预计会诱导Th-和CD8+ T细胞反应。当接种疫苗的受试者遇到真正的流感病毒时，预先存在的免疫力会通过病毒M2e立即被激活，并停止宿主细胞中的病毒复制。这随后阻止了流感病毒向周围传播。此外，M2e肽和NP蛋白在流感病毒类型中保存得很好，因为相对较低的免疫选择压力。鉴于这一优势，M2e-NP融合蛋白引起的预先存在的免疫力能够交叉保护疫苗接种者免受季节性流感和具有大流行潜力的抗原变异流感病毒的侵害。这一策略是当前许可的流感疫苗的替代方案，这些疫苗需要每年重新配制，以满足下一个主要循环的流感亚型，因此防止抗原不匹配，这很可能导致严重的死亡率和发病率。在蛋白质生产方面，M2e-NP融合蛋白可以作为重组亚单位疫苗在异源表达宿主中生产；因此，它不包含可能对免疫受损个体构成健康威胁的活病毒颗粒或病毒基因组。此外，制造过程不涉及在受精卵中病毒孵化，因此避免了鸡蛋过敏问题。因此，这种类型的疫苗对所有年龄组都是安全的。此外，与结构和大小受限的化学合成蛋白或肽不同，M2e-NP融合蛋白的抗原性和免疫原性被认为具有优势，如（i）NP蛋白配备了突出的T细胞表位，以及（ii）M2e-NP蛋白的亚基能够组装成在外部展示多个M2e肽副本的颗粒。总之，这些特性使M2e-NP融合蛋白成为通用流感疫苗的潜在候选物。迫切需要一种通用流感疫苗来对抗所有IAV亚型提供交叉保护。目前许可的流感疫苗面临一个主要问题：抗原不匹配的风险可能会降低疫苗的效力。此外，疫苗仅针对流通的流感亚型，没有为具有大流行潜力的AIVs提供充分保护，如禽流感H5N1。为了解决上述问题，通用流感疫苗必须包含在几乎所有流感亚型中都能找到的一个或多个保守的流感蛋白。保守蛋白必须能够诱导交叉保护性细胞介导和体液免疫，以最小化流感感染的严重性。流感M2e肽和NP蛋白都符合通用流感疫苗的要求。将M2e和NP作为融合蛋白结合是一种有希望的通用流感疫苗配方，可以提供更广泛和持久的保护，以抵御不同的流感病毒。
