Nature---昼夜节律影响中风治疗效果？这篇Nature文献揭示神经保护疗法的潜在转化困境

背景介绍：动物实验与临床不一致的谜团

研究设计：三种神经保护疗法的详细实验

1. 常压氧疗法（NBO）：通过给啮齿动物提供100%的氧气来减少脑梗死体积。
2. 自由基清除剂α-苯基丁基氮化物（αPBN）：用于减少中风后自由基对脑组织的损伤。
3. NMDA受体拮抗剂MK801：通过阻断NMDA受体，减少神经元的过度兴奋和死亡。

1. 图1a：展示了昼夜节律在啮齿类动物与人类中的差异。图中标明，啮齿类动物的昼夜节律与人类相反：啮齿类动物在夜间处于“活动期”，而人类在白天处于“活动期”。这意味着大多数啮齿类动物实验是在它们的“非活动期”（白天）进行，而临床试验则是在人类的“活动期”（白天）进行的中风患者中开展，这种差异可能导致实验结果无法有效转化到临床。
2. 图1b：该图展示了常压氧疗法（NBO）在大鼠模型中的实验结果。实验对大鼠进行了100分钟的中脑动脉闭塞（MCAO）手术，NBO组接受了100%氧气治疗，控制组仅接受了30%氧气治疗。结果显示，NBO在大鼠的“非活动期”（白天）显著降低了脑梗死体积（左侧图），但在“活动期”（夜晚）则未能取得同样的效果（右侧图）。此外，研究还发现，实验在“活动期”中脑梗死体积相对较小，这表明夜间大鼠的脑损伤可能更小。
3. 图1c：为了排除梗死体积过小导致NBO在“活动期”无效的可能性，研究团队使用了更温和的60分钟中风模型。结果再次表明，NBO依然只能在“非活动期”降低脑梗死体积（左侧图），在“活动期”中则无效（右侧图）。
4. 图1d：该图展示了自由基清除剂α-苯基丁基氮化物（αPBN）在小鼠模型中的实验结果。在60分钟中风模型中，αPBN同样仅在“非活动期”有效降低了脑梗死体积（左侧图），而在“活动期”无效（右侧图）。
5. 图1e：该图展示了NMDA受体拮抗剂MK801在小鼠模型中的实验结果。MK801在“非活动期”有效减少了永久性中风模型中的脑梗死体积（左侧图），但在“活动期”中却无效（右侧图）。
6. 图1f：作为对照实验，研究团队比较了“非活动期”和“活动期”中，60分钟暂时性中风和永久性中风两种不同模型下的梗死体积。结果显示，梗死体积在这两种模型中均较小，但与前面的发现一致，常规的神经保护疗法在“活动期”中效果不佳。

总结：图1展示了昼夜节律对神经保护疗法疗效的显著影响，无论是常压氧疗法（NBO）、自由基清除剂αPBN还是NMDA受体拮抗剂MK801，这些治疗都在啮齿类动物的“非活动期”（白天）有效，而在它们的“活动期”（夜晚）疗效不佳。这说明昼夜节律的不同是导致这些疗法从动物实验到临床试验转化失败的重要原因之一。

实验结果一：常压氧疗法的昼夜节律差异

实验结果二：αPBN和MK801的昼夜节律影响

实验结果三：激光斑点成像揭示半暗带变化

实验结果四：体外实验支持昼夜节律假设

1. 图2a：展示了通过**激光斑点成像（Laser Speckle Imaging）**在中风后不同时段（ZT5–7和ZT17–19）的脑血流分布。ZT5–7表示“非活动期”（白天），ZT17–19表示“活动期”（夜晚）。成像结果显示，在“活动期”（ZT17–19）的脑血流梯度（从健康区域到缺血区域的过渡）更陡峭，而在“非活动期”（ZT5–7）的血流梯度相对平缓。这意味着“活动期”的缺血半暗带区域（介于正常血流与缺血核心之间的区域）比“非活动期”更狭窄。
2. 图2b：该图定量分析了激光斑点成像中血流梯度的变化。左侧图展示了不同脑部区域的血流变化，表明ZT17–19（活动期）小鼠的血流衰减得更快。右侧图则进一步定量比较了不同时间段下的血流变化，发现“活动期”小鼠的血流减少速度更快，缺血半暗带区域（定义为血流保持在30–50%正常水平的区域）更狭窄。
3. 图2c：进一步比较了缺血半暗带的宽度，图中显示，“活动期”小鼠的半暗带明显比“非活动期”更窄。缺血半暗带是神经保护治疗的主要靶区，通常是神经元有可能存活的区域。较小的半暗带意味着“活动期”中风的可治疗区域更小，治疗难度也更大。
4. 图2d：该图展示了脑梗死体积在12至72小时内的增长情况。结果表明，虽然脑梗死体积在72小时后都有所增加，但“活动期”小鼠的梗死体积增长较慢。这与前面发现的半暗带更小一致，暗示了在“活动期”大脑受到的损伤可能较轻。
5. 图2e：该图展示了中风后24小时内的细胞死亡情况。通过TUNEL和fluoro-jade染色技术标记死亡细胞，图中显示了“非活动期”（ZT3–9）与“活动期”（ZT15–21）小鼠的脑组织切片。可以看到，“活动期”小鼠的缺血半暗带区域内的TUNEL阳性细胞（死亡细胞）更少，这表明细胞死亡在“活动期”更不活跃。
6. 图2f：进一步定量分析了细胞死亡率，比较了“非活动期”和“活动期”小鼠的细胞死亡情况。结果显示，在“活动期”中的半暗带区域，TUNEL阳性细胞和fluoro-jade阳性细胞的比例明显较低，这意味着“活动期”小鼠的细胞死亡较少，脑损伤扩展速度较慢。

总结：

1. 图3a：展示了通过地塞米松诱导的小鼠神经元的昼夜节律基因表达。研究人员使用地塞米松模拟昼夜节律，诱导神经元中的Per1和Per2基因的表达，这些基因通常在昼夜节律中起关键作用。在6小时后，Per1和Per2表达上升，对应于“活动期”；而在12小时后，Per1和Per2表达下降，对应于“非活动期”。这为后续实验提供了昼夜节律的体外模型。
2. 图3b：展示了实验设计流程。神经元被暴露于缺氧和葡萄糖剥夺（OGD）条件下，分别在“活动期”和“非活动期”添加神经保护疗法αPBN或MK801进行处理，随后再进行24小时的再氧化，以评估细胞存活率。
3. 图3c：展示了αPBN对神经元的保护效果。在缺氧和葡萄糖剥夺条件下，αPBN仅在“非活动期”有效减少了神经元死亡（图中“Dex 12 h”），而在“活动期”（图中“Dex 6 h”）中效果不明显。这与体内实验的结果一致，表明神经保护效果依赖于昼夜节律。
4. 图3d：展示了MK801对神经元的保护效果。与αPBN类似，MK801在“非活动期”能够有效减少神经元死亡，而在“活动期”中无显著效果。这进一步证明了神经保护疗法的效果受昼夜节律的影响。
5. 图3e：展示了在缺氧和葡萄糖剥夺后，神经元的谷氨酸释放和活性氧（ROS）生成。实验发现，在“活动期”，神经元释放的谷氨酸和产生的ROS明显少于“非活动期”。谷氨酸和ROS是神经元死亡的重要介质，较低的释放量表明“活动期”神经元的损伤机制可能较轻。
6. 图3f-h：展示了OGD诱导的神经元细胞死亡机制。实验分析了凋亡和坏死的相关信号分子（如caspase-3和RIP3激酶）的激活情况。结果表明，在“活动期”，这些死亡信号的激活程度较低，表明神经元在“活动期”不容易经历凋亡和坏死。这进一步解释了为什么神经保护疗法在“活动期”效果较差。
7. 图3i：展示了对多种细胞死亡机制进行联合阻断后的神经元存活情况。即使阻断了多种活性细胞死亡通路（如NMDA受体、AMPA受体、ROS、凋亡和坏死等），在“活动期”的神经元仍表现出更强的抗神经保护抵抗性，这表明“活动期”神经元的损伤机制不同，难以通过传统的神经保护策略进行干预。

总结：

临床启示：重新思考昼夜节律在治疗中的作用

对未来的展望