Science：脑心轴（前脑内侧束→丘脑腹内侧核→下丘脑背内侧核→疑核→迷走神经→心脏）
文摘
2024-06-28 22:19
湖北
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Yoshimoto A, Morikawa S, Kato E, Takeuchi H, Ikegaya Y. Top-down brain circuits for operant bradycardia. Science. 2024;384(6702):1361-1368. doi:10.1126/science.adl3353 心率（Heart rate，HR）可以在个体接收实时反馈时被自主调节。在一种HR生物反馈biofeedback的大鼠模型中，通过刺激新皮质和前脑内侧束medial forebrain bundle作为反馈和奖励，大鼠在30min内降低HR，在连续3h反馈训练后，HR降低约50%。降低的HR训练至少持续10天，整个训练期间大鼠表现出抗焦虑行为anxiolytic behavior并且血红细胞计数blood erythrocyte count升高。这种心动过缓通过灭活前扣带皮质（anterior cingulate cortical，ACC）神经元，投射到丘脑腹内侧核（ventromedial thalamic nucleus，VMT）的神经元而被预防。ACC-VMT通路的θ节律刺激复制心动过缓。VMT神经元投射到下丘脑背内侧（dorsomedial hypothalamus，DMH）和DMH神经元投射到调控心脏副交感神经元的疑核nucleus ambiguus。 生理参数，如HR（HR）、血压和体温，主要受自主神经系统autonomic nervous system控制，可以通过提供实时反馈给个体的专门训练来有意识地调节。尽管神经调节系统对生物反馈中大范围临床应用潜力巨大，但大脑对器官控制的神经基础仍知之甚少。受先前研究的启发，我们开发一个使用在自由活动的大鼠身上进行HR反馈的实验模型，以阐明控制HR反馈训练的神经机制，并研究潜在的神经生理活动。 我们的生物反馈训练范式biofeedback旨在降低大鼠的HR（图1A和视频S1）。通过监测胸大肌pectoralis major muscle的心电图（ECG）并从RR间期中每100ms计算1秒窗口内的平均HR。大鼠需要达到的目标HR设置为比HR反馈训练前1min的基线HR低15％。大鼠每2秒被通知当前HR与目标HR之间的差异，通过向右侧或左侧半球的初级躯体感觉皮层（somatosensory，S1）传递的刺激脉冲数量。具体来说，当前HR高于基线HR越多，就向右边桶状皮层barrel cortex传递更多刺激脉冲，而当前HR低于基线HR越多，就向左侧桶状皮层传递更多刺激脉冲（每次刺激最多5次）。如果大鼠将HR降低到目标HR以下，那么前脑内侧束（MFB）将被刺激作为神经奖励。当大鼠获得总共10次奖励后，目标HR将更新为比前1min的平均HR低15％，以便大鼠持续降低HR。每天进行3h的训练，并连续进行5天（图1B）。训练开始时的基线HR为428±21次/min（平均±标准差，n=17），并且所有被测试的大鼠都能在第一天的训练的前30min内开始降低HR（图1C）。第5天训练结束时HR降至231±14次/min，与第1天初始基线相比降低46.0±4.8％（图1D；表S1）。单独对MFB的刺激并未引起明显的HR变化（图S1，A和B），而桶状皮层的刺激也未改变胡须的运动（图S1，C和D）。![]()
图1. 闭环HR反馈对大鼠大脑的操作性HR控制产生影响。（A和B）HR反馈训练和行为任务的实验设计（A）和时间表（B）。在进行为期5天的HR反馈训练的同时，也在训练前的第1天，训练后的第5天，以及第10天和第15天进行高架十字迷宫（EPM）、开放场地（OF）和明暗盒（LD）测试。（C）在第1天大鼠HR反馈训练期间的HR时间表。（D）来自17只大鼠在为期5天的HR反馈训练期间的HR时间表。（E）在皮下注射盐酸多巴胺受体拮抗剂（0.03mg/kg SCH23390和0.03mg/kg eticlopride，1ml/kg，皮下）期间的大鼠HR。（F）在第1天到第5天的训练期间，预训练基线HR逐渐下降，训练结束后10天至15天的家养笼中HR减慢持续。（G）与（F）一样，但用于LF/HF。（H）在第1天训练开始和第5天训练结束时的体表温度红外热像图。（I）HR反馈训练期间HR与体温之间的正相关关系。（J）代表性大鼠在第1天和第5天探索高架十字迷宫的轨迹。（K）在开放空间中花费的总时间。与第1天相比（L和M）与（K）相同，但用于开放空间中HR变化（L）和HR变异性（M）。![]()
图 S1. MFB 刺激不影响HR，而 S1 刺激不影响触须运动。（A）一只代表性大鼠在 MFB 刺激前后HR的时间序列。两条曲线是分别在指定时间的心电图。（B）从 6 只大鼠中总结的 MFB 刺激对HR的影响。（C）一只代表性大鼠在 S1 刺激前后不同脉冲数下左右触须偏转的波形示意。（D）从 6 只大鼠中总结的 S1 刺激 5 脉冲前后 2 秒内触须偏转的弧长积分。 HR反馈对大脑初级视觉皮层primary visual cortex也诱导HR降低（图S2，A和D；n=6）。然而，当大鼠仅接收到MFB刺激奖励而没有HR反馈时，它们降低HR的效率较低（图S2，B和D；n=6）。另外，当桶状皮层和MFB在随机时间被刺激时，即使总刺激次数与HR反馈实验相匹配时，大鼠也无法降低HR（这里指的是随机S1/MFB组；图S2，C和D；n=5）。因此，适当的HR反馈刺激对于控制心动过缓有所要求。大鼠在训练的第5或第6天分别经皮下注射盐水或多巴胺受体拮抗剂（SCH-23390和eticlopride）的药物混合物，给药减弱训练效果（图1E，n=6）。![]()
图S2. V1皮层对HR的反馈还使得行为性HR控制成为可能。（A）在3天内，将刺激给予V1而非桶状皮层进行HR反馈训练期间的HR变化图。（B）与A相同，但仅进行MFB刺激而无HR反馈刺激。（C）与A相同，但对桶状皮层（S1）和MFB进行随机时间刺激的反馈。两种刺激的总数量与图1中相同。（D）自A-C中的四个实验条件总结的第3天3h后的HR变化与第1天基础HR的对比。 （E）从13只大鼠中收集的5天HR反馈训练期间的HR变异时间序列。 在异氟醚isoflurane麻醉下，大鼠没有出现HR反馈引起的心动过缓（图S3A，n=8）。在训练过程中，大鼠很少会偶尔入睡，之后HR降低恢复到基线水平（图S3B，n=4）。由于无法实验调节自发睡眠事件的时机、持续时间和深度，未对睡眠的影响进行量化。然而，观察表明HR反馈训练引起的心动过缓比自然睡眠时更为明显。生物反馈引起的心动过缓并未与呼吸频率显著降低同时出现（图S4）。![]()
图 S3. 麻醉状态下或在睡眠期间的HR反馈未能降低HR。（A）顶部示意图显示麻醉状态下HR反馈的实验时间表。每只大鼠在第 5 或第 6 天接受 1% 异氟醚。图中显示在有无麻醉状态下大鼠HR的变化。（B）当大鼠在HR反馈训练期间短暂入睡时HR变化的代表性示踪（深蓝色段）。睡眠由行为的安静、低电极肌电活动和新皮层慢波确定。![]()
图 S4. HR 反馈引起的心动过缓并未伴随呼吸率降低。（A, B）第一天进行 HR 反馈训练期间HR（A）和呼吸率（B）随时间的变化。从 5 只大鼠同时记录HR和呼吸率。 在5天的训练期内，每天训练前的基线HR逐渐下降（图1D黑色箱线图，n=17），表明心动过缓既发生在慢性阶段也发生在急性阶段。在5天的训练过程中，HR变异性逐渐增加，也表明慢性副交感神经优势（图S2E）。我们在第5天训练后监测大鼠在家中笼子里24h的HR，期间HR保持低于第1天训练前的基线HR，即使没有MFB刺激（图S5，A和B，n=6）。第10天和第15天仍然观察到心动过缓（图1F，n=9），并伴随着血压的长时间下降（图S5C）。HR变异谱图中低频（LF）（0.2-0.8Hz）与高频（HF）（0.8-3.5Hz）带的功率比（LF/HF）作为自主神经活动autonomic activity指数，显著低于第1天到第10天的训练前水平（图1G）。慢性心动过缓不能通过心脏功能障碍来解释，因为超声心动图和组织病理学检查未发现心脏运动或心肌细胞明显异常（图S5，D和E）。![]()
图S5. HR反馈改变生理构成。（A）实验时间表，连续记录5天训练后24h的HR。（B）24h内，家养笼中的HR保持低于基线HR（425.2 bpm）。（C）在训练前第1天和训练后第5天、第10天和第15天测量收缩压和舒张压（SBP和DBP）。降低的血压至少持续到第15天。（D）在进行5天反馈训练前后的典型超声心动图像中未发现心跳异常。实验在五只大鼠上重复，结果相似。（E）从代表性随机S1/MFB和HR反馈大鼠处获得的天青-伊红（HE）染色和Masson三色染色心室切片及其显微放大图。相同的检查在五只大鼠中重复以确保心脏组织或肌细胞中没有异常。（F）在训练第1天开始和第4天结束对血液进行采样，以测量SpO2水平和红细胞（RBC）的数量。（G）训练第1天后SpO2下降，但第4天没有。（H）经过4天训练后，红细胞计数增加，与第1天的基线相比。 利用红外热像仪监测体温变化，我们观察到在HR反馈训练后期，体温下降，第5天的最低体温平均达到29.7 ± 1.8°C（图1，H和I，n=7）。此外，血氧饱和度测量显示，第1天的训练显著降低SpO2（图S5，F和G，n=8）。然而，第4天的训练，尽管HR更低，却没有降低 SpO2，暗示长期心动过缓引起某些心血管功能的代偿性改善。作为一种代偿机制，我们观察到红细胞计数增加（图S5H，n=8）。在开放场地的视频观察中，尽管有慢性心动过缓和低体温，大鼠并没有减少其运动活动（图S6，A至C）。 HR变异性与焦虑有关。大鼠在进行高架十字迷宫测试后，经历5天的反馈训练，以检查持续的心动过缓是否影响焦虑相关行为（图1B）。与训练前的第1天相比，大鼠在第5天和第10天（但不是第15天）在开放空间open arms中停留的时间更长，而开放空间被认为可触发焦虑（图1，J和K，n=9）。在第1天训练之前，大鼠进入开放空间时HR上升，HR变异性下降，表明应激增加，但在进行5天训练后没有这种情况（图1，L和M）。随机S1/MFB组中未观察到在开放空间中停留时间增加的情况（图S6，F至H）。在开放场测试中，大鼠在第5天更多时间呆在远离墙壁的中央区域（图S6D），在进行5天训练后，在中央区域内HR上升的情况没有观察到（图S6E）。在明暗箱测试中，大鼠在进行5天的反馈训练后，在明亮室内停留时间更长，明亮室内停留时间被认为是低压力状态的一个指标（图S6I，n=6）。![]()
图S6. HR反馈训练减少焦虑相关行为而不影响运动活动。（A）顶部：在第1天、第5天、第10天和第15天进行开放场测试的一只代表性大鼠的轨迹。底部：开放场测试中大鼠的代表性热图。（B）训练后开放场中总行程未明显改变。（C）运动速度的分布（2秒间隔）在各天之间没有显著差异。（D）相对于总时间，在第5天中央区域停留的时间百分比高于第1天。（E）与D相同，但是用于停留在中央区域时的HR变化。（F）在随机时间进行S1和MFB刺激的时间表。随机刺激持续5天，同时在第1天训练前、第5天训练后以及第10天和第15天进行高架十字迷宫（EPM）测试。（G, H）与图1J和K相同，但为在随机时间进行S1和MFB刺激。（I）在光/暗过渡测试中在光腔中停留的时间占总时间的百分比。 为确定参与操作性心动过缓的脑区，我们在对立早基因immediate-early gene c-Fos进行IHC标记的整个大脑切片中寻找HR反馈时被激活的细胞（图2，A和B，图S7）。HR反馈组的数据与随机S1/MFB组的数据进行比较。在具有HR反馈的大鼠的新皮层中，前扣带皮质（ACC）和前岛皮质（anterior insular cortex，AIC）这两个区域表现出c-Fos阳性细胞数量的显著增加（图2C，随机S1/MFB组和HR反馈组中每个脑区感兴趣的6个和8个区域）。为研究这些区域是否参与操作性心动过缓，我们通过局部注射肌肉松解麻醉剂到双侧ACC或AIC抑制它们的神经元活动。我们在随机顺序中的训练第5或第6天给每只大鼠注射肌肉松解麻醉剂或生理盐水（图2D）。通过将肌肉松解麻醉剂注入ACC（图2E，n=13）而不是注入AIC（图2F，n=10），暗示反馈诱发的心动过缓受到影响。由于将肌肉松解麻醉剂注射到ACC未能抑制水浸泡诱发的心动过缓（附图S8，A到C），说明ACC在操作性心动过缓中起到作用但不在生理反射心动过缓中。![]()
图2. HR反馈诱导的心动过缓需要ACC神经元活动。（A）在（C）中绘制数据的区域在示意冠状断面中标示。（B）HR反馈训练第5天后ACC和AIC中c-Fos免疫染色的共聚焦图像。在对照的随机S1/MFB组中，独立于HR，将同样数量的刺激随机应用于桶状皮层和MFB。（C）HR反馈和随机S1/MFB刺激中c-Fos阳性细胞的密度（上）及它们的比例（下）分别绘制在每个脑区。（D）神经元灭活的实验时间表。每只大鼠在第5或第6天以随机顺序接受0.05mg的巫妖酸或盐水。（E）（左）ACC穿刺尖端的确切位置的脑图和照片。SR-101与药物同时注射，并在事后确认其荧光。（右）接受ACC中巫妖酸（绿色）或盐水（黑色）处理的大鼠在训练期间的HR。（F）与（E）相同，但适用于AIC。（G）来自ACC、M1和嗅球（OB）的LFP记录的示意图，连同ECG和肌电图（EMG）数据。右边的尼氏染色切片图像和相应的脑图表示ACC、S1和MFB中电极轨迹的事后确认。（H）ECG、LFP和EMG数据的迹线。（I）操作训练期间ACC LFP的傅立叶功率谱。在7.1Hz处存在最大峰值。训练期间平均θ（7-8Hz）功率增加。（J）在训练期间沿LFP节律（7-8Hz）的相位中，具有兴奋性的ACC神经元的射频极坐标图。尖锐的沿θ周期的射频时间。![]()
图 S7. 高反馈训练激活特定脑区的神经元。显示具有高反馈和随机 S1/MFB 刺激的大鼠 c-Fos 免疫反应的代表图像。![]()
图 S8. ACC不参与心动过缓反射。（A）鼻水浸泡实验设计。将肌注注入ACC。大鼠在30°C水中进行鼻部浸泡3秒。（B）肌注治疗大鼠中潜水心动过缓反射的代表性数据。曲线为心电图信号。（C）0.05 μg肌注或生理盐水治疗的大鼠对鼻水浸泡的HR反应。 局部场电位（Local field potentials，LFPs）记录自前扣带皮层（ACC）（图2，G和H）。功率谱展现出θ波段振荡，在生物反馈训练期间达到峰值7.1Hz（图2I，n=8）。θ波振荡（7-8Hz）的功率随着训练时间的增加而增加（图2I）。由ACC神经元发射的尖峰与ACC θ振荡明显同步，平均相位为178°（图2J）。与ACC同时记录的初级运动皮层或嗅球的LFPs中没有明显的θ波振荡（图S9，A和B）。 将AAVdj-hSyn-GFP注射入ACC进行顺行示踪Anterograde tracing，显示GFP阳性轴突纤维在丘脑腹内侧核（ventromedial thalamic nucleus，VMT）和丘脑背内侧核（mediodorsal thalamic nucleus，MDT）中丰富分布（图S10）。![]()
图 S9. 在高奖赏反馈训练期间，M1 或嗅球中都没有出现θ振荡。（A）在操作训练期间记录的M1的LFP的傅里叶功率谱。（B）操作训练期间嗅球中LFP的傅里叶功率谱表现出1.6 Hz的峰值。![]()
图 S10. ACC 神经元的轴突主要观察在 MDT 和 VMT 中。将 AAVdj-hSynGFP 注入 ACC，检测到整个大脑中一系列冠状切面中的 GFP 阳性 ACC 轴突纤维。共聚焦图像显示注射部位（ACC）以及 MDT 和 VMT 中的 ACC 轴突。切片经过神经示踪™ 435/455 蓝色荧光 Nissl 染色。 VMT或MDT到ACC的逆行示踪Retrograde tracing显示，使用红色RetroBeads揭示在经过3h的HR反馈训练后大鼠ACC神经元中存在RetroBeads信号和c-Fos免疫反应性（图S11A）。通过在ACC中双重感染AAVdj-EF1a-Flex-Synaptophysin-mCherry和retroAAV2-pmSyn1-EBFP-Cre到VMT，标记VMT投射到ACC的神经元显示出存在于ACC的5层和6层中的mCherry阳性神经元，并且mCherry阳性神经元突起达到MDT，表明VMT投射的ACC 5/6层神经元也将它们的轴突侧支发送到MDT（图S11B）。![]()
图S11. ACC到MDT投射介导操作性心动过缓。（A）左侧示意图表示红色RetroBeads注射到MDT或VMT。右侧照片显示表达c-Fos的ACC神经元投射到MDT和VMT的典型共聚焦图像。（B）左侧示意图表示AAVdj-EF1a-Flex-Synaptophysin-mCherry注射到ACC和retroAAV2-Cre注射到VMT。右侧图像显示层5/6的ACC神经元向VMT有轴突分支到MDT。（C）左侧示意图表示AAVdjCAG-FLEX-GFP-2A-TetToxLc或AAVdj-CAG-FLEX-GFP在双侧ACC注射，用于抑制ACC到MDT的突触输入。右侧：MDT投射的ACC神经元中TetToxLc的表达降低HR反馈训练的效果。 我们通过在ACC注射AAVdj-CAG-FLEX-GFP-2A-TetToxLc或AAVdj-CAG-FLEX-GFP（对照组），并将retroAAV2-pmSyn1-EBFP-Cre注入VMT或MDT，阻止从ACC-VMT或MDT的神经传导（图3A和图S11C）。在VMT投射或MDT投射的ACC神经中表达TetToxLc明显减弱HR反馈训练的效果，尤其是在第4和第5天（VMT：图3B，TetToxLc，n=7，GFP，n=8；MDT：图S11C，TetToxLc，n=7，GFP，n=6）。 我们利用转录体外显子富集方法对VMT-投射的ACC神经元的基因表达模式进行RNA测序分析（图S12A）。与总裂解产物（对照组）相比，VMT-投射的ACC神经元的免疫沉淀RNA中富集几种基因（图S12B）。基于GO术语（图S12C）和单个基因（图S12D）的聚类分析表明，VMT-投射的ACC神经元在ACC细胞中代表着一个独特的类别。![]()
图3. HR反馈诱导的心动过缓需要来自ACC到VMT的神经递质传递。（A）左侧图示展示将AAVdj-CAG-FLEX-GFP-2A-TetToxLc或AAVdj-CAG-FLEX-GFP病毒注入ACC，以及retroAAV2-pmSyn1-EBFP-Cre注入VMT。右侧共聚焦图像显示大鼠ACC和VMT的注射部位。（B）ACC神经元中TetToxLc的表达降低HR反馈训练的效果。（C）左侧示意图显示在ACC中表达ChR2病毒。右侧共聚焦图像显示ACC的注射部位和一个膜片钳VMT神经元。（D）在存在或不存在10 mM DNQX和20 mM AP5的情况下，VMT神经元对蓝光照射的丘脑皮质脑片VMT的反应。（E）来自3只大鼠的10个神经元的EPSC波幅汇集在一起。（F）（左）对VMT施加7 Hz的五个蓝光脉冲时记录的EPSCs。右图显示EPSC振幅对不同频率的五脉冲刺激的相对变化。![]()
图 S12. 投射 VMT 的ACC神经元在ACC中构成一个独特的细胞类别。（A）翻译核糖体亲和纯化用于基因分析的示意图。（B）对比前扣带皮质细胞中所有基因的每百万基因转录本（TPM）值的成对散点图，比较整个（对照组）和免疫沉淀 RNA。（C）顶部：使用 TPM 数据对基因本体（GO）术语进行层次聚类。底部：基于每个 GO 术语所属基因的 TPM 值变化的条形图。每个 GO 术语从5只大鼠中的 3-657 个基因（D）UMAP 降维图绘制 n = 1,679 个基因。为每个基因创建一个二进制矩阵，根据它是否适合 52 个 GO 术语，然后使用 UMAP 对矩阵的维度进行降低。 我们通过在ACC注射AAVdj-hSyn-FLEX-jGCaMP7f和VMT注射retroAAV2pmSyn1-EBFP-Cre在VMT投射ACC神经元表达遗传编码钙指示剂GCaMP7f，并从ACC第5层进行光导记录（图S13A）。与LFPs一样，在HR反馈训练期间，钙活性中发生θ波振荡，并随着训练的进行而增强（图S13，B和C）。然而，当GCaMP7f在ACC神经元中非特异性表达时，θ波振荡仅微弱地观察到（图S13，D-G）。![]()
图S13. VMT-投射的ACC神经元在HR反馈训练期间特异性地表现出θ波振荡。（A）左图所示，病毒注射AAVdj-hSyn-FLEX-jGCaMP7f进入ACC和retroAAV2-pmSyn1-EBFP-Cre进入VMT，以记录VMT-投射的ACC神经元的钙信号。共聚焦图像显示一只代表性大鼠ACC和VMT的注射部位。（B）jGCaMP7f信号ΔF/F（=（F - F0）/F0）在操作训练期间的原始轨迹和它们的7至8 Hz带通轨迹的代表性示踪。（C）钙信号的快速傅里叶变换（FFT）功率谱图。数据为8只大鼠的5天均值±标准差，显示出7.9 Hz的峰值。平均θ（7-8 Hz）功率在训练期间趋于增加。（D-F）与A-C相同，但钙钠转运CPM途径的8只接受AAVdj-CaMK2-jGCaMP7f病毒注射的大鼠。（G）VMT-投射的ACC神经元的平均θ功率大于ACC总体神经元。 为电生理学上确认来自ACC到VMT的一次突触传导，我们通过在ACC中注射AAVdj-CaMKIIa-hChR2（H134R）-EYFP来在ACC神经元中表达通道蛋白-2（ChR2），并在急性丘脑皮质切片中以电压钳配置对VMT神经元进行膜片钳记录（图3D）。在对ACC轴突末梢进行蓝光照射后，VMT神经元显示出兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic currents，EPSCs），这些EPSCs被一种包含10 mM DNQX和20 mM AP5的混合物所阻断（图3E，合计10个来自3只大鼠的神经元）。这种谷氨酸能传递表现出对重复激活的短期突触易化，即在短时间间隔重复应用蓝光脉冲时，EPSCs的幅值逐渐增加。当将重复刺激的频率设置为7 Hz的节律时，易化最明显（图3F，合计9到10个来自3只大鼠的神经元）。 当在体内以7Hz的频率光刺激VMT投射的ACC神经元时，大鼠的HR会降低（图4A，n=6）。与通过生物反馈诱导的心动过缓不同，光遗传学诱导的心动过缓不会受到多巴胺受体拮抗剂的影响（附图S14A，n=6）。我们还在其他频率上应用蓝光刺激，包括0.5、2和20Hz（图S14，B-D，n=6）。所有刺激频率都会降低HR，但7Hz刺激具有最强的心动过缓效应（图4B）。在YFP表达的对照大鼠中未观察到心动过缓效应（图4C，n=6）。通过刺激MDT投射的ACC神经元也可以诱导心动过缓（图4D，来自5只大鼠的8次实验），但不能通过刺激AIC投射的ACC神经元（图4E，来自5只大鼠的8次实验）或次级运动皮层来诱导心动过缓（图4F，来自4只大鼠的8次实验）。![]()
图4. ACC-VMT神经通路介导操作性心动过缓。（A）左侧示意图显示将AAV-CaMKIIa-ChR2-EYFP或AAV-CaMKIIa-EYFP注射到ACC中。共聚焦图像显示ACC中的注射部位和VMT中的光纤轨迹。右侧图示显示在7Hz蓝光刺激下的HR反应。（B）对VMT的不同频率的蓝光刺激对0-20min期间的平均HR的影响。 （C）在ACC中注射AAV-CaMKIIa-YFP，并在VMT中植入光纤。未表达ChR2的ACC-VMT通路对7Hz蓝光刺激下的HR没有变化。（D-F）将AAV-CaMKIIaChR2-EYFP注入ACC，并将光纤植入（D）MDT，（E）AIC，或（F）M2。在ACC到MDT通路中，7Hz蓝光刺激导致HR下降，但在ACC到AIC或ACC到次级运动皮层（M2）通路中没有效果。![]()
图 S14. 光遗传学引发的心动过缓不需要多巴胺受体活性。（A）HR对7Hz蓝光脉冲刺激的反应。这三种处理分别间隔48h进行，光遗传刺激在每次处理后的第15min开始。（B-D）分别为蓝光刺激下HR在0.5Hz（B）, 2Hz（C）和 20Hz（D）下的变化。 先前的解剖研究表明，VMT与下丘脑背内侧核（dorsomedial hypothalamus，DMH）存在突触连接，并参与HR调节。通过观察急性脑片中光遗传学激活ChR2表达VMT轴突末梢所引起的DMH神经元中谷氨酸能EPSCs，我们证实这种突触连接（图5，A-C，n = 4）。VMT-DMH传递在7Hz重复刺激时表现出短暂的抑制（图5D）。为寻找投射到DMH的VMT神经元的上游神经元，我们使用跨突触示踪方法来单突触标记投射神经元的输入。具体来说，我们在VMT中注射AAVdj-CMV-FLEX-TVA-mCherry-2AoG和retroAAV2-pmSyn1-EBFPCre注入DMH后3周，将EnvA-RVDG-GFP注入VMT（图5E）。GFP标记的突触前神经元分布在多个脑区，其中在ACC最丰富（图5F，n=5）。 在MDT中未检测到显著的突触前神经元，表明前扣带而非MDT向投射到DMH的VMT神经元投射。使用相同的示踪方法，我们寻找投射到VMT投射到ACC神经元的突触前神经元（图5G），并发现MDT和AIC含有大量GFP阳性神经元（图5H，n=6）。![]()
图5. ACC→VMT→DMH→Amb通路构成支配操作性心动过缓的自上而下通路。（A）左侧示意图显示ChR2在VMT中的病毒表达。右侧共聚焦图像显示VMT中的注射点和一个膜片钳的DMH神经元。（B）DMH神经元对蓝光照射到DMH的反应，在存在和不存在10mM DNQX和20mM AP5的丘脑皮质切片中。（C）EPSC振幅汇总自3只大鼠的6个神经元。（D）与图3F相同，但是对VMT-DMH纤维进行光刺激。（E）左上示意图显示投射特异性单突触狂犬病病毒的注射点。共聚焦图像显示VMT中的注射点（右上：广域图像；左下：高放大图像）和ACC中的输入神经元（右下，绿色）。（F）输入细胞与投射至DMH的VMT神经元的比例。（G）与（E）相同，但是对投射至VMT神经元的ACC神经元的输入神经元。共聚焦图像显示ACC中的注射点和MDT、AIC中的输入神经元。（H）输入细胞与投射至VMT的ACC神经元的比例。（I）左上方图示AAVdj-hSyn-GFP注入到DMH以检测DMH神经元到Amb的轴突。右上方共聚焦图像显示DMH中的注射点和Amb中DMH神经元的轴突。切片用抗钙结合蛋白和抗VGluT2免疫染色，用荧光尼氏染色作为对比。（J）左侧示意图显示在Amb中注射红色RetroBeads。右侧的共聚焦图像显示Amb中的注射点和投射到Amb的DMH神经元。（K）自上而下的HR控制的神经通路。 DMH神经元据报告投射到疑核（Amb），这是一个通过迷走神经向心脏发送长投射纤维的脑干结构。我们还通过来自DMH神经元的前行标记（图5I）和来自Amb的逆行标记（图5J）证实DMH对Amb的轴突内部连接。DMH轴突在与调节心功能的calbindin阳性的Amb神经元附近传导（图5I）。 在这项研究中，我们建立一个啮齿动物的HR反馈系统，并证明大鼠可以通过基于生物反馈的强化学习调节他们的HR。HR的降低是通过中枢多巴胺信号传导介导的，但不是主要受呼吸调节驱动，也不是在麻醉状态下发生。因此，运动减心动过缓很可能是通过主动的、自上而下的机制产生的。 我们检测到生物反馈诱导的心动过缓中的ACC θ节律活动。由于物理刺激（如水浸泡、缺氧和超声波）引起的心动过缓反射甚至在麻醉或去大脑动物中也会发生，并且不需要ACC，因此ACC可能作为HR调节的自上而下中枢。这个想法可能与人类冥想中ACC θ节律增加有关。ACC的光纤光度记录显示，θ节律波在训练期间并非消失，而是非常弱，而投射到VMT的ACC神经元表现出强θ节律振荡。这一观察结果表明ACC细胞子群（即投射到VMT的ACC神经元）被招募进行θ节律振荡。ACC可能由多个平行回路组成，可以同时处理不同水平的信息，这与ACC参与疼痛、认知、注意力和情绪等多种功能的事实一致。 ACC已被认为参与调节自主神经系统，对ACC的电刺激可以引发自主神经反应。实际上，ACC神经元投射到下丘脑和脑干等主要自主神经结构。然而，从ACC到心脏的详细神经通路仍有待阐明。我们采用单突触和双突触示踪技术相结合，揭示从ACC到心脏的整个神经通路。我们还发现，在训练过程中，投射至VMT和MDT的ACC神经元均被激活。我们推测ACC和MDT形成一个循环回路，作为θ波振荡的产生器。然后，这一回路的活动从ACC传播到VMT，随后传递至DMH、Amb和心脏。尽管我们不排除其他可能的心脏控制通路，但这项研究为心脏和大脑之间的相互作用开辟新的研究途径。这项研究中进行的所有实验均获得东京大学实验伦理委员会的批准（批准号：P29-11），并遵守美国国立卫生研究院关于对大鼠的照料和利用指导方针。总共有133只8-12周龄的Long Evans雄性大鼠（日本SLC）参与训练，而总共有6只3-6周龄的Long Evans雄性大鼠参与体外膜片钳记录。这些大鼠单独饲养，并按照12h光照/12h黑暗的时间表进行管理，灯光在上午7:00熄灭。手术是为植入电极以刺激内侧束（MFB）和桶状皮层，电极微推进器用于电生理记录，导管用于药物灭活ACC或AIC，以及光纤用于光遗传学激活ACC。手术还用于病毒注射。麻醉后用异氟烷气体（1-2.5%）麻醉大鼠，将其安装到立体定向仪器上，并从双眼区到小脑做一条长2cm的中线切口。为植入双极刺激电极（TOG217-049c，Unique Medical），使用高速钻（SD-102，Narishige）在MFB或桶状皮层上制作直径约1mm的三个开颅孔。手术切除硬脑膜。刺激电极被插入MFB（前后（AP）：-2.0mm，内外侧（ML）：2.0mm，头尾（DV）：7.8mm）或桶状皮层（AP：-1.5mm，ML：±5.0mm，DV：1.8mm）。为将HR反馈给V1，刺激电极被插入V1（AP：-5.5mm，ML：±4.0mm，DV：1.0mm）而不是桶状皮层。电极设备包括一个核心主体和一个定制的电接口板（EIB36-PTB，Neuralynx公司），可容纳7个四极束（即28个通道）用于ACC，两个嗅球和M1的LFP通道，一个ECG通道，一个EMG通道以及两个地/参考通道。LFP电极由直径为17微米的聚酰亚胺包覆铂-铱（90/10%）丝（加利福尼亚精细线公司）制成，电极尖端镀铂以将电极的阻抗降低至1 kHz时的150-300 kΩ。为记录ACC的LFP，每个手术口径约为1mm的颅骨切开术在ACC上方（AP：3.0mm，ML：±1.0mm）进行，并且手术切除硬脑膜。ACC四极束的尖端被降低到皮层表面，并在手术的最后一步中插入大脑2.2mm。如所述植入M1和嗅球、ECG、EMG和LFP的电极。简而言之，将一个线电极（AS633，Cooner Wire）连接到左胸大肌以记录ECG信号，同时另一个线电极植入到斜方肌以记录EMG信号。然后使用手术刀小心地切除头皮。使用高速牙医钻进行一个操作口径约为0.9mm的圆形颅骨切开术。用外科螺丝（直径1.4mm，长度3mm）记录M1的LFP时，使用椎间盘不锈钢螺丝；而用于记录嗅球LFP的是较小的螺丝电极（直径1.0mm，长度4mm）。三个螺丝电极的放置是立体定向引导的（M1：AP 3.2mm，ML 3.0mm；嗅球：AP 10.0mm，ML 1.0mm）。此外，植入两个不锈钢螺丝电极位于小脑上方（AP：-9.6mm ML：±1.0mm）以用作地和参考电极。通过牙科水泥将导线和电极组件固定在头骨上。为实施ACC或AIC药理性灭活的导管植入，分别在ACC或AIC左右半球上制作两个手术孔，每个手术孔的直径约为1mm。手术中切除硬脑膜。导管分别插入ACC（AP: 1.7mm，ML: ±2.3mm，45°角度，DV: 2.6mm，30°角度）或AIC（AP: 3.0mm，ML: ±4.0mm，DV: 4.5mm）。在未给药时，将假导管插入导管内并保持覆盖。为抑制ACC向VMT或MDT的输入，通过拉制玻璃微管注射AAVdj-CAG-FLEXGFP-2A-TetToxLc（300 nl，2.59 × 10 13 vg/ml，Addgene #32640）或AAVdj-CAG-FLEX-GFP（3.36 × 10 13 vg/ml，Addgene #28304）到ACC（AP：3.0 mm，ML：±1.0 mm，DV 2.0-2.2 mm），而重组逆向AAV2-pmSyn1EBFP-Cre（300 nl，2.24 × 10 13 vg/ml，Addgene #51507）则被注射到VMT或MDT中。注射速率为100 nL/min，使用Hamilton注射器和注射泵控制器推动注射。微管被留在原位另外5min以便组织扩散后慢慢收回。AAV载体是根据先前描述的方法生成的。数据收集于手术后三周开始，以允许大鼠恢复并表达病毒蛋白。用于VMT光遗传激活的光纤植入需要进行四个开颅手术，每个手术部位直径约为1mm，在ACC和VMT上方进行。手术中切除硬脑膜。使用玻璃电极双侧注射总体积为300nL（每min100nL）的AAVdj-CaMKIIa-ChR2-EYFP（7.28 × 10 13个病毒颗粒/ml，Addgene #26969）或AAVdj-CaMKIIa-YFP（9.85 × 10 15个病毒颗粒/ml）到前扣带区（AP：3.0mm，ML：±1.0mm，DV 2.2mm），并在VMT植入光纤（200微米，8mm，Doric）（AP：-2.0mm，ML：±2.5mm，DV：6.9mm，角度13°）并使用牙科水泥固定。为激活AIC的光遗传学，上方进行开颅手术，并在AIC植入光纤（200微米，5mm，Doric）（AP：3.0mm，ML：±4.0mm，DV：4.5mm）。进行M2区光遗传激活时，上方进行开颅手术，并在M2区植入光纤（200微米，4mm，Doric）（AP：1.0mm，ML：±1.5mm，DV：1.0mm）。进行MDT区光遗传激活时，上方进行开颅手术，并在MDT区植入光纤（200微米，8mm，Doric）（AP：-2.0mm，ML：±2.5mm，DV：4.8mm，角度10°）。数据收集在手术后三周开始，以确保大鼠康复并确保病毒蛋白的表达。对于光纤光度计实验，将300 nl AAVdj-CaMK2-jGCaMP7f（1.60 × 10 14 vg/ml）注入到ACC区域，或者将300 nl AAVdj-hSyn-FLEXjGCaMP7f（1.53 × 10 14 vg/ml, Addgene #104492）注入到ACC区域，同时将300 nl 重组逆转录AAV2-pmSyn1-EBFP-Cre（2.24 × 10 13 vg/ml，Addgene #51507）注入到VMT区域。病毒注射后，将光纤光学探头（400 μm, 4 mm, Doric）插入到与病毒注射同侧的ACC区域，并固定在原位。进行病毒追踪实验时，在ACC（AP: 3.0 mm，ML: 1.0 mm）、VMT（AP: -2.0 mm，ML: 1.0 mm）、MDT（AP: -2.0 mm，ML: 1.0 mm）、DMH（AP: -2.0 mm，ML: 0.2 mm）或Amb（AP: -12.0 mm，ML: 2.0 mm）上进行直径约0.8 mm的手术开窗。对于逆行追踪，向每个目标区域注射300 nl红色RetroBeads（Lumafluor）。为确认ACC-VMT的轴突内部连接以及其在MDT中的分支，向ACC注射总体积为300 nl AAVdj-EF1aFlex-Synaptophysin-mCherry（5.11 × 10^13 vg/ml），同时向VMT注射总体积为300 nl重组逆行AAV2-pmSyn1-EBFP-Cre（2.24 × 10^13 vg/ml，Addgene # 51507）。为确认DMH到Amb的轴突内部连接，向DMH注射总体积为300 nl AAVdj-hSyn-EGFP（1.4 × 10^14 vg/ml，Addgene #50465）。对于一种特定于投影的单突触狂犬病病毒示踪方法，称为追踪输入和输出的关系，使用重组狂犬病病毒（RV）。总体积为300nLAAVdj-CMV-FLEX-TVA-mCherry-2A-oG（1.94 x 10 13 vg/ml，Addgene #104330）或AAVdj-CAG-FLEX-TCB（2.77 x 10 12 vg/ml，Addgene #48332）和AAVdj-CAGFLEX-oG（7.58 x 10 12 vg/ml）被注入到VMT或ACC中，同时总体积为300nL重组retroAAV2-pmSyn1-EBFP-Cre（2.24 x 10 13 vg/ml，Addgene #51507）被注入到DMH或VMT中，以在VMT到DMH或ACC-VMT神经元中特异性补充TVA和G。三周后，EnvA-RVΔG-GFP（2.6 x 10 7 IU/ml，Addgene #32635）被注入到VMT或ACC中，用于表达TVA和G的神经元的单突触逆行传播狂犬病病毒。10天后，大鼠被用于组织学。我们将表达RVΔG-GFP的GFP（从AAVs）和mCherry（从AAVs）的神经元称为“启动细胞”，而仅阳性表达GFP的神经元则被称为“输入细胞”，代表它们与启动细胞的直接突触前连接。为翻译核糖体亲和纯化，总共注射300nL的retroAAV2-hSynEGFP-Rpl10a（8.78 × 10 13 vg/ml）到VMT中。表达四周后，解剖ACC并进行核糖体免疫沉淀以沉淀附着在Rpl10a上的信使RNA（mRNAs）。建立一个啮齿类HR反馈系统，用于基于获取的数据计算HR并通过与目标HR进行比较提供反馈。为获取ECG数据（采样频率：2 kHz），我们使用一个数据采集系统（CerePlexDirect，Blackrock Microsystems），结合cbPy，这是一个用于实时控制Blackrock Microsystems神经信号处理器（NSPs）的开源Python API。根据ECG中的RR间期，在窗口宽度为1秒的情况下，每隔100ms计算一次HR。为计算HR，原始ECG数据经历初始处理，包括带通滤波器（10-100 Hz范围内的3阶Butterworth滤波器）和陷波滤波器（49-51 Hz范围内的3阶Butterworth滤波器）。然后通过识别信号强度超过总值的1%而检测到R峰中的相对最大值。大鼠必须实现的目标HR值被确定为比基线平均HR降低15%。大鼠通过刺激脑桶状皮层或V1来感知当前HR与目标HR之间的相对差异。刺激脉冲的数量（从1到5）取决于两者之间的偏差程度。这些评估每2秒进行一次，并将结果传输给Arduino，然后根据接收到的刺激信息向刺激器（Master-9，A.M.P.I）发送方波数字信号，从而产生刺激皮层的矩形对称双相电流。电流的参数如下：幅度（每个正负相位），180-200μA；相位持续时间（每个相位），1.0ms；相间间隔，0秒；脉冲间隔（正相位启动和下一个开始之间的时间），100ms。当大鼠将其HR降至低于目标HR的情况下持续10秒，MFB将被激活作为神经奖励。电流的参数如下：幅度，90-100μA；相位持续时间，50微秒；相间间隔，0秒；脉冲间隔，100ms；脉冲组持续时间，500ms。当大鼠获得总共10次奖励时，目标HR将更新为基准1min前HR的15%减少，使大鼠持续需要进一步降低其HR。行为测试分别在第1天（训练前）、最后一天的训练（第5天）、训练结束后的第5天（第10天）和第10天（第15天）进行。对于高架十字迷宫的记录，每只大鼠被放置在中央广场，面对一个开放空间，并被允许自由探索迷宫装置10min。高架十字迷宫由丙烯腈丁二烯-苯乙烯树脂制成，由一个中央广场（10×10平方cm）和四条臂组成（50cm长×10cm宽，两个无栏杆的开放空间和两个由横墙围成高40cm的封闭臂）。迷宫离地88.5cm，有四盏32瓦的顶部荧光灯照明，分别在开放空间和封闭臂产生100勒克斯和40勒克斯的光照强度。在一个由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯聚合物制成的圆形场地中（宽900mm×深900mm×高300mm），将老鼠放置在中心位置，顶部为开放式。在亮度为150勒克斯的房间进行为期10min的测试。摄像机被放置在场地中心上方，以监视老鼠的即时位置。该容器被分为九个相等的部分，形成外围区和中央区，中央区的尺寸为300×300mm。中央区的亮度为150勒克斯，边缘的亮度为130勒克斯。测量每只老鼠在10min内行进的总距离。实验开始时，将大鼠放置在一个黑暗的房间里，房间顶部覆盖着丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（宽440mm×深650mm×高330mm），并允许它们在这个黑暗的房间和光明房间（宽440mm×深650mm×高330mm）之间自由移动，通过一扇门。然后放开大鼠自由探索房间的时间为10min。详细记录大鼠在光明箱中停留的时间。为获得muscimol的注射，假穿刺管被移除，然后插入不锈钢穿刺管（直径：0.37mm，EICOM）。注射速度为0.25μL/min，注入0.9% NaCl溶液中溶解的0.5μL muscimol（浓度为0.05μg/μL）或盐水（0.9% NaCl）。然后，注射穿刺管被拔出，至少在注射后1min内再次插入假穿刺管。15min后开始HR反馈测试。muscimol的空间分布通过以0.25μL/min的速度注入0.5μL磺酸罗丹明101（50μM）在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中的估计。注射后15min内大鼠被处死。我们测试多巴胺受体拮抗剂对HR反馈训练或ACC-VMT通路的7Hz光遗传刺激的HR减慢效应。大鼠在训练前（第5天）或光遗传激活前15min接受0.03 mg/kg SCH-23390（1 ml/kg, s.c.）和0.03 mg/kg eticlopride或生理盐水（0.9% NaCl）的注射。为诱导潜水迷走神经反射，小鼠在异氟醚麻醉下，并在37°C加热坐垫上进行心电图记录，在鼻部接触过程中。在20min内，每隔5min进行3次在热中性水中（30°C，3-5秒）的鼻部浸渍。光纤跳线连接到表达ChR2的大鼠，并通过一个ferrule（Precision Fiber Products, Chula Vista）连接到激光源（473 nm，100 mW，Lucir Inc.）。光脉冲的持续时间和强度分别为10ms和3.0-5.0 mW。每20秒施加10秒的0.5、2、7和20 Hz的脉冲。刺激电极组件连接到一根六芯电缆上。该电缆进一步连接到一个隔离器（Master-9, A.M.P.I.）和一个刺激器（ISO-Flex, A.M.P.I.）。记录接口组件的电接口板连接到一个数字头戴式（CerePlex M, Blackrock Microsystems），数字化信号被放大并传输到数据采集系统（CerePlexDirect, Blackrock Microsystems）。电生理数据以2 kHz的采样率进行数字化，并在0.1-500 Hz之间进行滤波。单位活动经过750 Hz的高通滤波器放大和处理。超过触发阈值（-50μV）的尖峰波形被记录下来，以30 kHz的速度记录1.6 ms。使用一个465nm的Doric Connectorized LED（CLED_465，Doric Lenses）产生光。通过荧光立方体将GCaMP7f的输出在500-550nm范围内进行滤波，然后由光电二极管转换为电压，再通过一个时间常数为30ms的锁相放大器放大。在465nm激发下获取的钙离子信号中的运动伪影被405nm激发下的信号纠正，这是GCaMP7f的等吸光点。所有图像分析均使用Doric Neuroscience Studio软件（版本5.4.1.23; Doric Lenses）进行。在每次实验中，光度信号强度F通过以下公式标准化到基线：ΔF/F =（F - F0 ）/F0 ，其中F 0 代表所分析信号的平均荧光。由于长时间记录期间的光漂移或信号漂移影响的任何基线光度值都通过自定义MATLAB脚本进行校正。急性切片是从5周龄表达ChR2的长埃文斯大鼠制备的。大鼠用异氟醚麻醉后，心脏灌流冰冷含氧改良人工脑脊液（mACSF：222.1 mM蔗糖，27 mM NaHCO3，1.5 mM NaH2 PO4，2.5 mM KCl，0.5 mM 抗坏血酸，1 mM CaCl2，和 7 mM MgSO4），然后处死并取下大鼠的大脑。剪切包含VMT和DMH的冠状大脑块（300 μm厚）以斜向从前向后方向使用振荡刀（VT1200S，Leica）在冰冷含氧 mACSF 中以100 μm/s的切割速度切割。然后，这些切片转移到35°C的含氧人工脑脊液中，成分为127 mM NaCl，1.6 mM KCl，1.24 mM KH2 PO4，1.3 mM MgSO4，2.4 mM CaCl2，26 mM NaHCO3，和 10 mM D-葡萄糖，并在液体中培养至少30min。在32°C以3-4 ml/min的速率灌流含氧人工脑脊液的浸没式培养室中进行全细胞膜片钳记录。通过红外差分干涉显微镜从视觉上鉴别进行电压钳记录。膜片吸管（3-6 MΩ）填充有一个包含127 mM CsMeSO4，8 mM CsCl，10 mM HEPES，1 mM MgCl2，10 mM 磷酸肌酸二钠，4 mM MgATP，0.3 mM NaGTP，和 0.2 mM EGTA 的溶液（pH 7.2-7.3，280-295 mOsm）。然后，信号被放大并以20 kHz的采样速率数字化，使用MultiClamp 700B放大器和Digidata 1440 A数字化器进行控制，由pCLAMP 10.3软件（Molecular Devices）控制。使用LED（LEX2-LZ4，Brain Vision）刺激ChR2。光脉冲持续时间为2.5ms，强度为1.5毫瓦。进行重复刺激时，在每15秒内可应用2、7和20 Hz的五个脉冲。在记录过程中，人工脑脊液被更换为含有10 μM DNQX和20 μM AP5的液体。一款红外热像仪（InfReC R550，日本航空电子有限公司）用于监测训练过程中体温的变化。血压在训练开始前的第1天、训练结束后的第5天，以及第10天和第15天进行尾部测量（SBP-2000，Softron）。大鼠在清醒状态下被限制，采用3-15 MHz曲棍球形线性阵列探头（ARIETTA Prologue，富士胶片）进行经胸心脏超声心动图检查。利用脉搏血氧仪（MouseOx，STARR）测量SpO2来评估氧合状态。通过将测量芯片固定在使用1%异氟醚麻醉的大鼠颈部来测量SpO2。采集大鼠尾静脉血，在训练开始前的第1天或训练结束后的第4天进行红细胞计数，利用流式细胞术和电阻抗法（富士胶片）计数红细胞。记录完成后，大鼠经由异氟烷气体过量麻醉。然后，大鼠经心脏灌流0.01 M磷酸盐缓冲液和4%甲醛（PFA）溶液以及0.01 M磷酸盐缓冲液，随后被斩首。大脑通过浸泡在4%PFA中过夜后在振荡切片机（DTK-1000 N, Dosaka EM）上冠状切割成100 μm厚的薄片。得到的连续切片放置在玻璃载玻片上，并进行新月紫染色。此过程包括在水、乙醇和二甲苯中冲洗切片，然后用新月紫进行对比染色。目镜玻片采用固定剂覆盖。如果电极位置发现在目标脑区之外，则排除数据进行后续分析。用相差显微镜（BZ-X710, Keyence）拍摄新月紫染色图像。对于免疫染色，通过低温切片机（HM520, Thermo Fisher Scientific Inc.）或者振荡切片机（DTK-1000 N, Dosaka EM）把脑子冠状切割成50 μm或100 μm厚的薄块。漂浮切片在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA, 01863-77, Nacalai Tesque, Inc.）和0.3% Triton X-100在PBS中阻断1h，然后在4°C孵育过夜与以下的初级抗体：抗c-Fos的兔抗体（1:8000, 226 008, Synaptic Systems）、抗囊泡谷氨酸转运蛋白2（VGluT2）的豚鼠抗体（1:1000, VGluT2-GP-Af810, Frontier Institute）和抗钙结合蛋白的山羊抗体（1:400, Calbindin-Go-Af1040, Frontier Institute）。这些切片进一步与以下二级抗体在室温下孵育1.5h：Alexa Fluor 488偶联的羊抗兔IgG（1:1000, A-11034, Thermo Fisher Scientific Inc.）、Alexa Fluor 594偶联的驴抗豚鼠IgG（1:1000, 706-585-148, Jackson ImmunoResearch）和Alexa Fluor 647偶联的驴抗山羊IgG（1:1000, A-21447, Thermo Fisher Scientific Inc.）。切片在室温下用神经示踪435/455蓝色荧光尼斯尔染料（1:200-1:500, N21479, Thermo Fisher Scientific Inc.）或DAPI（2.5 μm/mL, D1306, Thermo Fisher Scientific Inc.）对比染色1.5h，用Prolong Diamond防褪色试剂（P36961, Thermo Fisher Scientific Inc.）或水基安装介质（TA-030-FM, Lab Vision Corporation）安装到显微镜载玻片上。使用配备10×空气目镜（CFI Plan Apo Lamda S 10×, NA0.45, Nikon）、20×空气目镜（CFI Plan Apo VC 20×, NA0.75, Nikon）和100×油目镜（Apo TIRF 100× Oil, NA1.49, Nikon）的激光扫描共聚焦显微镜（A1-HD25, Nikon）拍摄切片。对心脏进行组织学分析，取出心脏，用冰冷的生理盐水充分冲洗，然后在4%甲醛的PBS中固定。将组织块包埋在石蜡中切片（12 μm），用苏木精-伊红染色或Masson三色染色。在将retroAAV2-hSyn-EGFP-Rpl10a注射到VMT中的5只大鼠的ACC中提取mRNAs。大鼠在颈部被砍断后，将其大脑取出。5只大鼠的ACC被放入一个试管中，在500μL冷却均质缓冲液（50mM Tris-pH 7.5，12mM MgCl2，1％NP-40，100μg/mL环丙沙星，100mM KCl，1x HALT蛋白酶抑制剂，0.5mM DTT，1mg/mL硫酸肝素钠和0.2单位/ L RNasin）中用Dounce超声均质。在12,000×g离心30min后，收集50μl上清液作为包含总ACC mRNA的输入样品。然后，将2μL兔抗GFP抗体（ab290，Abcam）和100μL磁珠（1004D，Invitrogen）加入剩余上清液中，并在4°C下旋转过夜。用高盐缓冲液（50mM Tris-pH 7.5，12mM MgCl2，1％NP-40，100μg/mL环丙沙星，300mM KCl）在磁性支架上洗涤免疫沉淀样品3次，然后使用RNeasy Plus Mini Kit（50，Qiagen）从输入和免疫沉淀样品中提取剩余沉淀RNA。使用SMART-seq HT Plus kit（Cat No. R400749）从输入和免疫沉淀样品制备文库。在NovaSeq 6000（Illumina）上进行测序。使用RIAS可视化（RIAS; rhelixa.com）进行基因本体（GO术语）分析。老鼠的行为是通过连接在天花板上的网络摄像头以每秒30帧的速度进行监测的。视频与计算机进行同步，用于进行电生理记录。根据老鼠头部的x和y坐标来量化老鼠所走过的通路。使用DeepLabCut跟踪老鼠头部的位置。提取帧并利用K均值聚类算法标记，以封装每个视频中的图像多样性。生成的训练数据集包括来自五只老鼠的200帧视频。这些手动标记的图像用于优化一个标准预训练网络ResNet-50的权重，该网络专门设计用于检测头部位置。95%的手动标记帧用于训练DeepLabCut网络，另外5%用于网络评估。为了解HR反馈引起的神经振荡活动，将ACC中的LFP信号转换为频域数据，使用快速傅里叶变换。基于频谱下的面积计算θ（7-8 Hz）频段中的LFP功率。心电图分析包括应用20至200 Hz的带通滤波器，并检测50ms或更长间隔的R波作为峰值。随后手动去除任何检测到的噪音。我们进一步使用快速傅里叶变换分析HRV的时间变化，并将其表示在基于频率的领域中。利用傅里叶频谱，计算低频（LF; 0.2-0.8 Hz）和高频（HF; 0.83.5 Hz）功率以及低频功率与高频功率的比值。基于LF功率与HF功率的比值评估交感神经功能。肌电图分析利用20 Hz的降采样信号数据，计算每秒的均方根值（rmsEMG）作为功率测量。对于呼吸频率，对1-10 Hz范围内的嗅球LFP波形执行小波变换，并确定具有最高强度的频率作为呼吸频率。脉冲排序是使用图形聚类软件MClust进行离线处理的。聚类是在多维参数空间的二维投影中进行的，比较波形幅度、峰值到谷底幅度差异和波形能量，每个四电极的四个通道都进行测量。通过识别由波形参数定义的聚类，实现离线检测具有100μV和基线两倍幅度的脉冲单位。通过计算L比率和隔离距离来评估聚类质量。当L比率低于0.30且隔离距离高于15时，将聚类分类为细胞。还利用自相关和交叉相关函数等额外的分离标准。结合脉冲的不应期有助于增强对细胞成功孤立的信心。使用自定义的MATLAB程序（MathWorks）进行数据分析。所有比较单样本和特定值的统计分析，或比较两个样本的统计分析，均使用自助法检验或单因素方差分析（ANOVA）进行。在自助重采样方法中，随机生成10000个数据替代以确定p值。当数据成对时，计算比较数据之间的自助法置信区间。如果95%置信区间的上限为负值或下限为正值，则认为存在显著差异。对于非成对数据，从两组的合并数据中获得自助法置信区间，并进行相同的检验。多重比较使用Bonferroni校正。数据量满足自助法要求。对于相关性分析图，显著性基于Pearson相关系数确定。为评估数据的增长和下降趋势，使用Jonckheere趋势检验。相位分布使用Rayleigh均匀性检验。视频S1. 展示一只进行HR生物反馈训练的大鼠。该视频是从安装在舱室天花板上的摄像头拍摄的，并实时播放。反馈和奖励刺激的位置和时间显示在视频的右侧。随着HR的降低，大鼠的运动活动也减少。请注意，尽管在视频中的刺激时播放哔声，实验过程中并未播放声音。
