四川大学吕弋、刘睿团队：一种结合无酶扩增和单纳米颗粒分析的CRISPR/Cas12a检测法用于Amol水平microRNA检测

CRISPR系统的卓越生物相容性、可调编程能力和独特的转切割特性，使其成为开发先进分析方法的重要方案。由于特定CRISPR相关蛋白（Cas）如Cas12a的高效转切割能力，基于此类系统的核酸定量分析已经在疾病相关核酸的检测中得到了实际应用。然而，CRISPR/Cas系统有时会出现灵敏度降低的情况，这就需要借助目标扩增技术来补充，如聚合酶链式反应（PCR）、重组酶聚合酶反应（RPA）、环介导扩增（LAMP）和滚环扩增（RCA）。尽管上述扩增技术能够提高CRISPR系统的分析性能，但也可能带来一些负面影响：(i) 引入额外的扩增酶试剂会显著增加实验环境的复杂性，并伴随更高的成本。(ii) 在扩增过程中可能引入污染的风险，例如引物残留，这些残留物可能干扰CRISPR检测的正常操作，导致结果偏倚。(iii) 扩增过程可能会通过生成与目标序列相似或相同的非特异性扩增产物来降低特异性，从而增加误解的风险。(iv) 扩增过程中的变异可能会影响目标序列的完整性，从而影响CRISPR/Cas检测系统的灵敏度，降低其准确性和可靠性。

来源：Chemical Communication 

针对上述挑战，四川大学吕弋教授及刘睿教授团队开发了一种均相无聚合酶参与的扩增策略，旨在通过杂交链式（HCR）扩增启动扩增，并与CRISPR/Cas12a体系结合，利用电感耦合等离子体体质谱的时间分辨单颗粒模式（Sp-ICP-MS）分析癌症相关miRNA（miR-21）的核酸检测方法。HCR利用核酸的自组装特性，无需额外的聚合酶，在简单的等温条件下实现多轮扩增。Sp-ICP-MS的时间分辨单颗粒模式已广泛应用于检测各种生物标志物，如核酸、蛋白质和小分子。该模式能够根据单个纳米颗粒的大小和浓度区分不同纳米颗粒的信号。因此，任何由于单颗粒大小变化引起的变化都可以在单颗粒模式下均匀检测到。此外，单个纳米颗粒保留了大量金属原子，意味着即使是单个纳米颗粒在Sp-ICP-MS分析中也能提供相当高的灵敏度。两者的结合实现了对癌症相关miRNA灵敏检测（检出限达到了amol）。该成果详见Chemical Communication 2024年10月发表的“CRISPR/Cas12a assay for Amol level microRNA by combining enzyme-free amplification and single particle analysis”。文章的第一作者是四川大学分析测试中心博士研究生张程超。

全文链接为： 

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/cc/d4cc04534c

来源：Chemical Communication 

▲图1  HCR-CRISPR/Cas12a纳米颗粒分析法用于miR-21检测的示意图

使用了一种特定的发夹DNA（H1），它可以识别并互补靶标miRNA（图1）。在靶标miRNA存在时，H1发生构象变化。随后，展开的H1可触发HCR级联反应，与H2和H3发生反应。这一策略能够将靶标miR-21转化为双链HCR复合物。这些双链DNA包含了能够激活Cas12a–crRNA复合物的PAM序列（图1中的黑色区域）。一旦激活，Cas12a的反式切割作用便可裂解用于互补交联ArmA/ArmB-AuNPs（图1 step 4: ArmA与红色部分交联；ArmB与蓝色部分交联）的Linker DNA。因此，根据miR-21的含量不同，CRISPR/Cas12a的反式剪切的激活程度则不同，导致在Sp-ICP-MS分析下形成不同强度的金纳米颗粒（AuNPs）聚集物。由AuNPs产生的信号被在Sp-ICP-MS模式下实时分析，且AuNPs的Sp-ICP-MS信号强度与目标miR-21的浓度在一定范围内呈现良好的线性关系，以及优秀的检出限。

作者首先研究了该分析方法所使用的AuNPs用于形成纳米颗粒聚集体并进行单颗粒检测的可行性，结果如下图所示，通过添加等量的ArmA/ArmB-AuNPs和不同浓度的Linker DNA。Linker DNA浓度的增加，纳米颗粒聚集体的强度也随之增加，所形成的纳米颗粒聚集体强度和Linker DNA浓度有良好的线性关系（图2a）。同时，从实时数据也可证明，随着Linker DNA浓度的增加，更多的AuNP聚集体被形成，并且颗粒强度增强（图2b–d）。此外，随着Linker DNA浓度的增加，样品的颜色逐渐从洋红色转变为透明。随后作者接下来使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步验证由靶标miR-21 诱导HCR扩增反应的可行性（图2e）。同时利用TEM表征了在不同miR-21浓度下所形成的AuNPs聚集体（图2f-g）。

▲图2  基于HCR-CRISPR/Cas12a用于miR-21单颗粒分析的可行性研究

该方法具有对癌症标志物靶标miR-21灵敏检测的能力，对miR-21检测的分析性能见下图。图3展示了该分析方法检测miR-21的线性范围（图3a-b）以及不同miR-21浓度下金纳米颗粒的分析结果（图3c-e）。图3f展现了该分析方法对于检测AFB1的特异性。同时作者使用该方法检测从四种不同细胞中提取的总RNA中的miR-21，包括人类乳腺腺癌细胞（MCF-7）、肝癌细胞（HepG2）、人类胚胎肾细胞（HEK293）和人类乳腺上皮细胞（MCF-10a）。如图3g所示，miR-21在MCF-7中的表达水平最高，其次是HepG2中的表达水平。HEK293和MCF-10a的miR-21水平最低。这些结果与关于miR-21在细胞中检测的已发表研究一致。

▲图3  该分析方法对靶标miR-21的分析性能（检测范围、线性，选择性和实际样）

此外，作者还使用收集到的2份健康血清临床样本进行加标回收分析。在加标回收实验结果中，该分析方法的加标回收率分别为100.2%～103.0%（血清A; RSD = 4.2%～12.0%）和102.0%～110.0% (血清B; RSD =2.70%～5.35%)。因此该分析方法也展现出了在复杂临床样品基质中分析的良好应用潜力。此外，该分析方法采用模块化设计，通过简单改变相应发夹DNA，即可实现对不同miRNAs的检测，满足不同组合的检测需求。

近年来，该课题组已开发了一系列电感耦合等离子体质谱的生物分析方法，用于构建高灵敏度和高准确度的生物传感平台（Food Chem., 2024, 443, 138557; Chem. Commun., 2024,60, 976-979; Chem. Sci., 2023,14, 6654-6662; Chem. Sci., 2022, 13, 6270; Anal. Chem. 2022, 94, 37, 12899–12906; Anal. Chem. 2022, 94, 15433−15439; Chem. Commun., 2022, 58, 4247; Anal. Chem. 2022, 94, 1787−1794）。

编辑 | 易  迪  

审阅 | 陈  姣  

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