中国清华大学医学院免疫所冯瑾 | 自然杀伤细胞毒性测定
学术
科学
2024-10-06 09:01
山东
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Bio-101 是 Bio-protocol 旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将选出一些文章与大家分享，本次我们选择的是中国清华大学医学院免疫所冯瑾的题为“自然杀伤细胞毒性测定“的方法文章。
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NK细胞的主要功能是杀伤功能，但因许多因素而改变，如基因敲除、基因突变、激活剂、抑制剂等，均有可能影响NK细胞的功能，为了研究这些因素对NK细胞杀伤功能的影响，我们采用抗体标记NK的IFN-γ和CD107a的方法间接检测NK细胞的杀伤活性。本实验方法提前给小鼠腹腔注射polyI:C激活NK细胞，然后收集小鼠脾脏细胞与靶细胞 (RMAS、YAC-1细胞)共孵育，并设立阴性对照和阳性对照 (PMA + Inomycin)，激活的NK细胞会发挥杀伤活性，上调IFN-γ的表达、增加颗粒酶的分泌。NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。关键词：NK细胞 细胞毒性 杀伤活性
机体内常有一些受刺激或感染而产生的异常细胞，如肿瘤细胞、受感染的细胞。而固有免疫和适应性免疫能先后识别并清除这些异常细胞。其中NK细胞在固有免疫中发挥重要的作用。NK细胞可以迅速识别并杀伤非己或异常的细胞，其杀伤机制主要分为直接和间接的方式。直接杀伤包括Fas/FasL途径和TRAIL/DR5途径，而间接的杀伤方式包括分泌IFN-γ和颗粒酶、穿孔素等。NK细胞不同于T、B细胞，不表达TCR、BCR，但其胞质内富含嗜天青颗粒，激活后颗粒明显增多，这些颗粒与其杀伤活性有关，所以NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。由于IFN-γ在胞内内质网合成、高尔基体加工后向外分泌，这将影响IFN-γ胞内染色检测的准确性，所以在共孵育1小时后需加入Brefeldin A和Monensin封闭高尔基体。孵育一段时间后，进行染色，即可流式检测。NK细胞中的细胞毒性颗粒主要存在于分泌性溶酶体，而CD107a又称溶酶体相关膜蛋白-1，是存在于溶酶体膜上的一种蛋白，当分泌性溶酶体分泌的过程中，溶酶体与细胞膜结合，CD107a随溶酶体膜与细胞膜结合而表达在细胞膜上，所以CD107a的表达程度与细胞脱颗粒程度正相关。 相比于其他测细胞毒活性的方法，51Cr释放实验虽然之前很长一段时间内是检测细胞毒活性的黄金标准，但51Cr具有半衰期短、放射性等缺点，而LDH释放法具有敏感性低的缺点。而本实验具有安全、便捷、特异等特点，便于研究各基因、蛋白等对NK细胞细胞毒性的影响，发掘其中的机制。 4. 60 mm x 15 mm平皿 (Corning, catalog number: 430166) 5. 15毫升离心管 (BD Falcon, catalog number: 352096) 11. CD107抗体 (eBioscience，catalog number: 50-1071, clone eBio1D4B, 1:100) 12. IFNγ抗体 (eBioscience, catalog number: 50-1071, clone XMG1.2, 1:200) 13. Poly I:C (InvivoGen, catalog number: 31852-29-6) 14. PMA (Sigma-Aldrich, catalog number: P1585) 15. Inomycin (Sigma-Aldrich, catalog number: 407951) 16. 红细胞裂解液 (eBioscience, catalog number: 00-4333-57) 17. Brefeldin A Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4506-51) 18. Monensin Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4505-51) 21. 1640培养基 (WISENT, catalog number: 350-006-CL) 22. 皂素 (Saponin, Sigma-Aldrich, catalog number: 47036)1. 每只小鼠腹腔注射200 μl 1μg/μl的polyI:C。2. 18小时后，处死小鼠，在超净台取小鼠脾脏，放于含100目筛网和3 ml PBS的60 mm x 15 mm平皿中用注射器活塞研磨，研磨至无明显组织块后收集细胞于15 ml离心管。4. 弃上清，加1 ml 1x红细胞裂解液，混匀，冰上裂解5 min。5. 裂解完成后可见液体红色变淡，加5 ml PBS终止反应，400 x g 离心5 min。6. 弃上清，1 ml PBS重悬细胞，100目滤网过滤并收集于1.5 ml EP管中。7. 取20 μl细胞液到新的1.5 ml EP管并加入180 μl PBS，混匀，用血球计数板计数。8. 调细胞浓度至 2 x 106/250 μl (8 x 106/ml)，24孔板，每孔加入250 μl细胞混悬液。9. 收集提前培养好的RMA-S和YAC-1细胞，计数。10. 调细胞浓度至 2 x 106/250 μl (8 x 106/ml)，每孔加入250 μl细胞混悬液至相应的孔中 (共500 μl)。11. 同时每孔加入0.5 μl CD107抗体。12. 设置空白对照孔 (+ 10% FBS 1640)，和阳性对照孔 (每孔加50 μl P + I混合液) 。13. 共孵育1个小时后，加入Golgi block (每孔0.5 μl) (Brefeldin A Solution (1,000x)，Monensin Solution (1,000x)) 。15. 收集培养的细胞，PBS洗一次，加入100 μl (含2% FBS的PBS) 预先配好的流式抗体混合物对细胞表面分子进行染色。17. 加PBS，400 x g离心 5分钟，洗两次。18. 弃上清，每管加入100 μl固定穿膜液，混匀，4 °C孵育1小时，中间混匀一次。19. 每管加入500 μl洗液，混匀，1,700 x g 离心5分钟，洗两次。20. 弃上清，每管加入100 μl IFNγ抗体 (洗液稀释)，4 °C孵育过夜。21. 加洗液，混匀，1,700 x g 离心5分钟，洗两次。22. 每管加入400 μl PBS，混匀，按照图1所示的画门策略，流式上机检测。NK细胞与RMAS或者YAC-1肿瘤细胞共同培养后，可以检测到NK细胞产生了IFNγ和CD107a，NK细胞的IFN-γ和CD107a的水平反映了检测的NK细胞的杀伤活性 (图 2)。
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图1. 流式检测画门策略
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图2. 流式检测NK细胞胞内IFNγ和CD107a的水平
董忠军实验室的工作得到清华大学免疫所的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章 (Chen等，2016)。1. Chen, S., Yang, M., Du, J., Li, D., Li, Z., Cai, C., Ma, Y., Zhang, L., Tian, Z. and Dong, Z. (2016). The self-specific activation receptor SLAM family is critical for NK cell education. Immunity 45(2): 292-304.冯瑾. (2019). 自然杀伤细胞毒性测定. Bio-101: e1010333. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010333.
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