免疫组化双染技术是常用的免疫组化方法之一，它通过使用两种不同种属的一抗、两种不同种属的二抗系统以及不同颜色的显色系统，可以在一张组织切片中同时检测2种或2种以上抗原的表达情况。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是一种过氧化物酶，它能将双氧水(H2O2)分解为氧气(O2)和水(H2O)，HRP可用DAB作为供氢体，H2O2作为底物，最终使抗原抗体结合的终产物呈棕黄色。HRP＋H2O2+DAB(电子供体)→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓HRP的显色底物，除了DAB，还有3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，产生红色沉淀,但该沉淀溶于有机溶液,因此必须在水溶性液体中封片）。和 HRP Magenta染料，作为HRP的底物，包含一种能够被HRP催化的化学前体。当HRP与其底物相互作用时，HRP催化氧化反应，这一反应过程中，底物被氧化并生成一种红紫色的不溶性沉淀物。对于IHC来说，DAB的褐色沉淀更有利于与苏木素染色做区分以及双色显色(和固红易区分，沉淀更牢固，不容易洗脱)，而且沉淀定位更准确，其他几种显色容易有非特异性显色。1. DAB显色剂可与有机封片剂一起使用，有机封片剂的折光率往往更好，获得的图像更清晰。2. DAB为联苯偶氮化合物，可诱发皮肤癌和膀胱癌，在显色操作过程中需注意防护。3. DAB显色后的残液需妥善处理，避免污染环境。4. DAB的使用在临床中也存在局限性。如果内源性过氧化物酶活性很高或者黑色素含量较高时,DAB就不是最佳的选择,应选用其他色原或者碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是小牛肠黏膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶,它通常结合的显色基团有四唑氨蓝(nitro-blue-tetrazolium，NBT)/5-澳-4-氯-3.明哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,BCIP)AP-Red、快红(Fast-Red)。其中AP-Red 和快红均在反向位点产生红色沉淀,但都易溶于酒精,在临床没有广泛使用。1. 固红的显色反应是在AP的催化下，萘酚AS-MX磷酸酯被水解为萘酚，萘酚和固红起偶联反应，在AP的活性部位形成红色的不溶性沉淀。
2. 当免疫组化核染是苏木素时，以双染体系来说，固红效果更好，一是结合牢固，二是更易和DAB及苏木素区分。
BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate, 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶(AP)的最佳底物组合之一。在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化合物。
1. NBT/BCIP 显微镜下可以由于pH值不同形成蓝色、紫色或棕色沉淀、是碱性磷酸预显色的最好选择。有文献报道，DAB经NBT/BCIP作用后可转变成为灰蓝色易于NBT/BCIP的蓝色产物相混淆。
2.NBT显色终产物容易褪色，切片颜色不能长期保存。
通过同时检测两种不同的肿瘤标志物，免疫组化双染技术能够更准确地识别肿瘤细胞。这种方法可以提高检测的特异性，减少假阳性或假阴性的结果。宫颈癌:
妇科P16/Ki-67免疫细胞化学双染检测主要辅助筛查宫颈癌和癌前病变。
1）P16是一种抑癌基因，能直接参与细胞周期调控，如果是正常细胞发生过性感染，P16不会有阳性表现。但如果感染持续存在，癌变的概率会增加，P16会呈阳性。
2）Ki67主要反映的是细胞的增殖情况，当出现阳性表现时，代表细胞增殖，阳性程度越高，细胞增殖速度越快。
3）宫颈p16和ki67双染检测是是针对宫颈活检来做的免疫组化项目，具体的含义如下：如果P16和Ki67阳性都超过鳞状上皮2/3层，就表明患者的宫颈病变是高级别病变，如果两者的阳性不超过鳞状上皮1/3层，则表明患者的宫颈病变是低级别病变，如果都是基底阳性就是正常的。
4）因为肿瘤的生长速度和病变的高低程度对病人的治疗和预后有很直接的关系，所以做宫颈组织p16与ki67双染检测就可以的判断患者的宫颈病变情况，做到早发现早治疗。
肿瘤细胞在其形态和生物标志物表达上往往具有异质性。免疫组化双染技术允许在同一张组织切片上观察两种不同的标志物，有助于识别同一肿瘤样本中不同亚群的细胞。血液肿瘤：
在诊断白血病和淋巴瘤时，可以通过同时标记不同的白细胞标志物（如CD34和PAX-5）来区分不同的白血病类型。
免疫组化双染技术可以帮助病理医生更精确地判断肿瘤的类型和恶性程度。可以同时检测CD20和CD3来区分B细胞和T细胞。传统的免疫组化方法通常需要多张切片来分别检测不同的标志物。双染技术可以在同一张切片上完成两种标志物的检测，减少了所需切片的数量，节约了试剂。通过免疫组化双染技术获得的肿瘤标志物表达信息，可以为临床医生提供关于治疗选择和患者预后的重要信息。通过同时检测ER和PR，可以帮助判断乳腺癌的激素受体状态，从而指导内分泌治疗。免疫组化双染技术虽然为病理学和生物学研究提供了强大的工具，但也存在一些挑战，主要包括：双染技术比单染技术更为复杂，需要精确控制实验条件，如抗体浓度、孵育时间、染色步骤等。两种染色信号可能会在某些区域重叠，导致难以分辨。特别是在两种标记物表达都很高时，信号的重叠可能会影响结果的解读。不是所有的抗体都适合进行双染实验。抗体的选择需要考虑其与第二种抗体的兼容性，包括抗体的来源、类型和亲和力。建议：1.考虑抗体的来源：尽量选择不同来源的抗体（兔和鼠）进行双染，因为它们通常不会相互交叉反应。
2. 选择不同种类的抗体：尽量使用不同类别的抗体（如IgG和IgM）可以减少抗体之间的交叉反应。
抗体交叉反应测试：在双染实验前，单独测试每种抗体，以确保它们不会与其他抗体或组织成分发生交叉反应。与单染技术相比，双染技术通常需要更多的试剂和更长的实验时间，这可能导致更高的成本。双染技术的标准化程度可能低于单染技术，这可能导致不同实验室之间结果的可重复性较低。建议：1. 预实验：在正式实验之前，进行预实验来测试不同抗体的兼容性和染色效果。这包括单独使用每种抗体以及将它们组合使用。对照设置：包括阳性对照、阴性对照和单染对照，以验证抗体的特异性和双染实验的有效性。在免疫组化双染中，选择合适的显色剂组合对于区分两个抗原的表达至关重要。选择哪种一抗（一级抗体）使用哪种显色剂通常取决于以下几个因素：抗原的位置、染色结果的对比度、显色剂的稳定性以及实验设计的整体目标。以下是一些建议：1.细胞核抗原：如果一个抗原主要定位在细胞核中（如p53、Ki-67等），通常使用DAB（棕色显色）来染色。DAB的棕色在细胞核中显色较好，与细胞浆或膜中的染色有明显区分。
2. 细胞浆或膜抗原：如果抗原主要定位在细胞浆或细胞膜上，使用红色显色剂（如AEC、Fast Red）或紫红色显色剂（如HRP Magenta）会更适合，因为红颜色在细胞质或膜上显得更为清晰。
1. DAB显色：DAB显色剂通常具有较高的稳定性，在长期存储时颜色不容易褪色。因此，它常被用于主要抗原的检测。
2. 红色显色剂：如AEC或Fast Red，相对较不稳定，但颜色鲜艳，可以为次要抗原提供良好的对比度。在需要短期观察的实验中，这类显色剂非常适合。
多重染色与背景减少：如果一个抗体在组织切片中的背景染色较强，可以选择使用与背景染色对比度强的显色剂（如DAB显色在深色背景中更明显）。1. 抗原A（细胞核定位）：选择DAB显色。
2. 抗原B（细胞浆或膜定位）：选择红色显色剂（AEC/Fast Red）或紫红色显色剂（HRP Magenta）。
在执行双重染色时，消除试剂之间的任何交叉反应性是非常重要的。特别是针对二抗都HRP酶底物的色素体。这就使得在执行第二次染色之前，有效地去除第一次染色中的所有酶活性变得非常重要。过氧化物酶封闭通常用于灭活组织中的任何内源性过氧化物酶活性。当组织中含有如图1B所示的来自二抗的额外过氧化物酶活性时，这并不能去除所有的HRP活性，因此需要额外去除过氧化物酶活性。之前已有描述使用两种HRP酶的顺序双重染色，在两次染色之间使用酸性封闭（例如pH2.2的甘氨酸-盐酸溶液、0.3M硫酸）。酸性封闭通过使抗体与它们的靶抗原分离，从而可以将它们洗掉。不管是共定位抗体还是不共定位抗体都是如此。
由于色素与组织共价结合，第一次染色的试剂仍然保留在组织中（图 4A-4E）。当进行第二次染色时，试剂会被残留的扩增系统识别（图 4C），并且残留的一抗会被扩增系统识别（图 4D）。在第二次染色期间，色素会沉淀（图 4E），从而导致颜色溢出。有研究做了酸封闭对于免疫组化影响的实验，在进行第二次抗体结合的时候，先加硫酸，以尽可能多地去除结合的抗体，然后再用过氧化物酶封闭处理组织中剩余的抗体-酶偶联物。因为，酸性封闭使抗体与它们的靶标分离，而过氧化物酶封闭则通过“过载”酶与它们无法摆脱的过氧化氢来起作用，因为不存在底物，最终使酶活性灭活。1. 使用核抗体（p63）和膜抗体（CEA）的单克隆小鼠抗体对扁桃体组织进行双染。
2. 由于这两种抗原不共定位，因此预期染色不会相互影响。使用相同的抗体组合进行染色，先使用 HRP Magenta 然后使用 DAB，反之亦然。
3. 当 DAB 作为第一种色素使用时，可以观察到交叉反应，无论是作为核周围的红色环（图 3A）还是棕色颜色的变化（图 3B）。
4. 当HRP Magenta作为第一种色素使用时，它变成更深的红色（图 3C 和 3D）。图 3B 中核的HRP Magenta是由于洋红色和蓝色苏木精颜色的组合而产生的。
1. 首先使用 HRP Magenta 对 CK Pan 进行完整的染色，然后使用 300 mM 硫酸和过氧化物酶阻断剂处理切片，以去除所有剩余的过氧化物酶活性。这之后是再次孵育扩增系统，然后是最终的 DAB 孵育。
2. p63和CEA的双重染色被重复进行，这次使用针对CEA的兔抗体，而p63抗体仍然是初始实验中的同一种小鼠抗体。
3. 如图6A–6D所示，双重染色的颜色没有受到污染，无论哪种色素体作为第一次染色的色素体（比较图3B与图6B以及图3D与图6D）。
1.使用了针对 CK Pan 和 CK 18 的抗体。CK 18 不被 CK Pan 抗体识别，但在前列腺腺中与 CK Pan 共定位。图 7A-7D 显示了细胞角蛋白双染的结果。
2.CK Pan 抗体对前列腺上皮的染色区域略大于 CK 18。这导致 CK 18 染色周围出现一圈 HRP Magenta 染色的 CK Pan（图 7A）或 DAB 染色的 CK Pan（图 7C）。只有当 CK 18 作为双染方案中的第一种抗体使用时，才会出现这种边缘。
3. 如果先对更大的 CK Pan 区域进行染色，则共定位的 CK 18 靶点会受到屏蔽。这大大降低了 CK 18 的染色强度。在 DAB 与 CK Pan 一起使用的情况下，共定位的第二个靶点并不容易看到（图 7B）。
当使用来自不同物种的抗体时，色素体的顺序并不重要，DAB和HRP Magenta色素体都可以作为第一次染色的色素体使用。当使用来自同一物种的抗体时，交叉反应性问题仍然存在。使用DAB作为第一次染色的色素体和HRP Magenta作为第二次染色的色素体，可以提供一致、满意的结果，且可检测到的交叉反应性最小。1.双重免疫组化技术在乳腺癌组织芯片中的应用，《中国医药生物技术》，2013年第2期2.Automated sequential chromogenic IHC double staining with two HRP substrates，PLoS ONE 13(11): e0207867. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0207867
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