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在这篇文章中，作者使用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）来研究可变剪接（Alternative Splicing，AS）在外周血单核细胞中的调控，并探索这种调控如何与免疫性疾病（如自身免疫疾病和炎症性疾病）相关。
1. 数据来源和样本
研究的数据来源于亚洲免疫多样性图谱（Asian Immune Diversity Atlas，AIDA），包括来自474名健康供体的外周血单核细胞（PBMCs）样本。供体来自东亚、东南亚和南亚等地区，涵盖了不同的遗传背景。每个供体的样本平均包含了大约1,959个单细胞。
总样本量： 474名供体
细胞数： 每个供体约1,959个单细胞，总计近1百万个单细胞
2. 单细胞RNA测序技术
研究中使用的是5'端单细胞RNA测序（5' scRNA-seq）技术，这不同于传统的3'端偏向测序。该方法通过对mRNA的5'端进行特定的捕获，从而获得更高的外显子覆盖率，并且能够提供更加详细的剪接信息。
5'端单细胞RNA测序技术的主要优势在于：
更好的外显子覆盖率： 通过对RNA的5'端进行测序，可以捕获到转录本的更大部分，并更好地识别外显子和剪接位点。
剪接信息： 5'端的测序能够提供足够的信息以识别可变剪接事件，并进一步推测剪接的特征。
技术细节：
测序平台： 文章使用了10x Genomics的5'端测序平台，这种方法能够在较低成本下捕获更多的剪接信息。
裂解和加帽： 作者利用了随机mRNA裂解和重新加帽（stochastic mRNA cleavage and recapping）方法，这是一种内源性细胞现象，它可以在同一个RNA分子上产生多个5'端，从而增加了外显子的覆盖率。
通过这种方法，测序的每个单细胞会得到大量的转录本数据，使得研究人员能够对每个细胞的基因表达情况进行详细分析，尤其是剪接事件的特征。
3. 剪接事件的分析
在获取了单细胞RNA测序数据之后，研究者使用了专门的分析工具来对可变剪接事件进行定量和识别。以下是主要的分析策略和工具：
SpliZ工具： 用于量化单细胞数据中的可变剪接基因（AS genes）。SpliZ能够处理剪接事件，尤其是基于短读片段的剪接分析，帮助研究者识别在单细胞中发生的剪接事件。
LeafCutter： 这是一种检测和量化RNA剪接的工具，用于识别内含子使用和外显子跳跃等常见的可变剪接事件。LeafCutter能够处理复杂的剪接模式，并且适用于单细胞RNA测序数据。
MISO（Mixture of Isoforms）： 这是另一种常用于量化可变剪接事件的软件，尤其擅长分析复杂的剪接模式，并能够为每个剪接事件提供可信度评分。
通过这些工具，研究人员能够在单细胞水平上：
定量可变剪接基因（AS genes），并识别哪些基因在不同细胞类型、性别和种族背景下表现出剪接差异。
识别剪接数量性状基因（sQTLs），这与基因型（如SNP变异）对剪接的调控作用有关。
4. 遗传变异与剪接的关联分析
研究中，作者不仅分析了剪接事件本身，还通过对遗传变异（如SNPs）与剪接事件之间的关系进行分析，探索了剪接数量性状基因（sQTLs），即基因型对剪接模式的影响。
cis-sQTLs：这些是影响剪接的局部遗传变异，通常位于剪接位点附近。通过分析这些sQTLs，作者能够识别基因内的遗传变异如何影响可变剪接。
trans-sQTLs：这些是作用于远程基因的遗传变异，通常影响不同基因间的剪接调控。通过这类分析，研究人员能够识别那些在不同细胞类型中影响剪接的广泛遗传因素。
文章还对比了不同性别和种族背景下的剪接变异，以研究性别偏倚的剪接模式和种族相关的剪接差异。
5. 功能验证与疾病关联
在数据分析的基础上，研究人员进一步进行功能验证，尤其是对于与免疫疾病相关的剪接事件。例如，研究发现某些与Graves'病（一种免疫系统相关的疾病）相关的剪接事件，这些剪接事件在东亚人群中表现出特定的遗传背景。
Graves'病相关的剪接事件： 研究人员发现了一个特定的sQTL（来自TCHP基因的剪接位点），这个sQTL影响了Graves'病的风险，这为疾病的遗传学研究提供了新线索。
6. 数据分析与可视化
为了展示数据，作者采用了层次聚类分析（Hierarchical clustering）和PCA分析等方法，识别了不同细胞类型和亚型之间的剪接差异。此外，通过热图和基因表达谱的可视化，展示了不同条件下剪接事件的分布和差异。
7. 创新点
5'端单细胞RNA测序： 与传统的3'端偏向测序不同，5'端测序能够提供更高质量的剪接数据，尤其在细胞类型特异性剪接分析中具有重要优势。
全基因组范围的剪接数量性状分析： 通过分析剪接sQTLs，作者能够深入探讨遗传变异如何调控剪接事件，并揭示了与免疫疾病相关的剪接模式。
原文；引文：Tian, C., Zhang, Y., Tong, Y. et al. Single-cell RNA sequencing of peripheral blood links cell-type-specific regulation of splicing to autoimmune and inflammatory diseases. Nat Genet (2024）
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