来源：饶议科学
2024 年 12 月 30 日英文文章上线
用生物化学、化学生物学和遗传学揭示睡眠调控的必要分子：钙调磷酸酶
余建军 1,2,*, 刘慧洁 1,2,*, 高瑞 1,*, 王涛 1,2,*, 李成钢 1,2,*, 刘玉祥 1,2, 杨璐 1,2, 徐颖 3, 崔云凤 2, 贾辰熙 3, 黄娟 1, 陈鹏 1, 饶毅 1,2,4,#
意义
睡眠的重要性不言而喻，但其分子和细胞机制仍然是个谜。包括我们在内的科学家已用遗传学方法在果蝇和小鼠中寻找参与睡眠调控的基因。但是在本研究中，我们率先应用生化和化学生物学方法来揭示睡眠调节的机理。我们发现钙磷酶（CaN）控制 SIK3 去磷酸化有位点特异性：可以作用于两个调节位点，但不能作用于酶活性所需的位点。用分子生物学方法降低 CaN 会降低睡眠 5 个多小时，这是在遗传突变小鼠身上观察到的最显著睡眠表型。这项研究揭示了睡眠调节中的蛋白磷酸酶-蛋白激酶途径，彰显了生化纯化和化学生物学方法作为研究大脑功能有效技术的价值。
本研究利用培养细胞进行蛋白质分离纯化，脑组织光交联，质谱分析脑内磷酸化蛋白组，发现磷酸酶对同一个蛋白质上不同位点的高度选择性去磷酸化，在体外用细菌表达的蛋白质重组磷酸酶活性，同时用了 4 种基因修饰小鼠、两种病毒介导的基因敲低的小鼠，密切结合分子生物学、生物化学、遗传学和脑电图记录而阐明基因与睡眠的关系。
引言
睡眠是动物的重要生理过程，受昼夜节律和稳态过程的调节。事实证明，在果蝇、小鼠、狗和人类身上采用遗传学方法能有效发现调节睡眠的基因。例如，发现了食欲素及其受体在维持觉醒方面的作用，以及盐诱导激酶 3（SIK3）在调节睡眠方面的作用。
由于睡眠只能在动物身上测量，而不能在分子上测量，因此我们最初和本领域的其他研究人员一样，都是依靠电生理学和遗传学来发现果蝇和小鼠睡眠分子和机理。
在评估了这些策略的优势和局限之后，我们决定尝试同时将经典的生物化学纯化方法和现代的化学生物学途径用于研究睡眠调控机制。我们的第一个目标底物是 SIK3，Yanagisawa 组和我们自己发现其特异位点磷酸化对睡眠调控非常重要。此前我们发现 SIK3 的特异磷酸化位点可指示睡眠需求并参与睡眠调节，因此我们使用 SIK3 蛋白作为底物，并对其调节因子进行生化鉴定，然后再在体内测试这些体外发现的磷酸化调节因子是否也能在体内调控睡眠。
蛋白质磷酸化水平在不同的睡眠-觉醒相关状态中有所不同。哺乳动物的睡眠被认为涉及蛋白激酶 A（PKA）、细胞外信号调节激酶（ERK）、单磷酸腺苷（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）、钙（Ca2+）/钙调蛋白（CaM）激酶 II（CaMKII）a 和 b、c-Jun N 端激酶（JNK）、SIK3、以及肝脏激酶 B1（LKB1）。CaMK2b 基因敲低的小鼠被报道每 24 小时的睡眠时间减少了 120 分钟以上，超过了其他已知的基因突变小鼠。
蛋白磷酸酶（PPases）是否参与哺乳动物睡眠知之甚少。1970 年代发现一种蛋白被命名为钙调磷酸酶（也称钙神经蛋白，calcineurin, CaN、PP2 或 PPP3），到 1980 年代确定其作为磷酸酶的功能。CaN 是唯一由钙离子（Ca2+）和钙调素（CaM）激活的磷酸酶，由二聚体组成，具有催化亚基 A 三种之一（PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3CC）和调节亚基 B 两种之一（PPP3R1 或 PPP3R2）。PPP3CA、PPP3CB 和 PPP3R1 表达的组织器官较为广泛，而 PPP3CC 和 PPP3R2 则在睾丸中特异表达。在脑中，PPP3CA 是含量最高的催化亚基，PPP3R1 是含量最高的调节亚基。
我们在确定了 SIK3 中 469 位点苏氨酸（T469）磷酸化的重要性后，再开始寻找 SIK3 的磷酸酶。虽然小鼠 SIK1 和 SIK2 中与 SIK3 丝氨酸（S）551 同等位点的缺失会导致与 SIK3 S551A 相同的功能增益（gain of function, GOF）表型，但我们发现 Sik1 或 Sik2 基因的缺失不影响小鼠的睡眠。因此，我们重点研究 Sik3。PKA 磷酸化 SIK3 T469 和 S551 位点后促进 SIK3 与 14-3-3 蛋白的相互作用。生化上，14-3-3 蛋白抑制 SIK3 活性，而 T469 或 S551 的缺失增加了 SIK3 的信号转导。T469 磷酸化的体内生理学功能意义尚不清楚。在此，我们将小鼠 SIK3 的 T469 突变为丙氨酸（A）（T469A），发现它导致小鼠睡眠增加。
我们采用了两种途径寻找去磷酸化 SIK3 的 T469 和 S551 的磷酸酶：从人胚胎肾脏（HEK）293T 细胞中用经典生物化学纯化 T469 和 S551 的磷酸酶，以及在小鼠脑中用化学生物学光交联寻找与 SIK3 相互作用的蛋白。都找到了 CaN 的催化亚基 PPP3CA。进一步体外生物化学重组实验表明，在 Ca2+、CaM 和 PPP3R1 的存在下，PPP3CA 可去除 T469 和 S551 的磷酸基团。PPP3CA 不能去除 T221 的磷酸基团，后者的磷酸化增强 SIK3 的激酶活性，并促进睡眠，且其水平可以反应睡眠需求。在体外培养的 HEK293T 细胞中，敲除 PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3R1，可以抑制钙离子诱导的 T469 和 S551（而非 T221）去磷酸化。在鼠脑通过分子生物学敲除 PPP3CA 或 PPP3R1 时，鼠脑中 T469 和 S551 的磷酸化水平增加，T221 的磷酸化不受影响。敲除 PPP3CA 基因在 24 小时内减少睡眠约 3 小时（187.6±13.0 分钟）。敲除 PPP3R1 基因减少 5 小时以上（349.3±21.5 分钟），超过了所有已知小鼠遗传突变体的睡眠变化。从睡眠变化的程度来看，CaN 是迄今为止发现的最重要的睡眠调节因子。我们成功地利用生化纯化和化学生物学发现了重要的睡眠调控分子，显示了遗传学外，还有生物化学和化学生物学对睡眠研究有巨大潜力。
来源：饶议科学
（注：本文仅截取了部分研究成果用于学术分享，欲了解详情请查阅原文章：睡眠与分子：生物化学与化学生物学的贡献｜老夫之乐）
