pull down实验又被称为蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是除酵母双杂交系统验证蛋白互作之外的又一方法。
1988年，Smith等人利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。[1]
此后，GST pull down作为体外检测蛋白相互作用的常用方法被广泛使用，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。
基本原理：
GST-pull down利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione S transferase，GST） 对GTH（谷胱甘肽，Glutathione，GTH）的亲和性，将bait-GST融合蛋白亲和固化在GTH磁珠上（bait-GST融合蛋白通过GST与固化在磁珠上的GTH结合结合），当目的蛋白溶液过柱孵育时，可从中捕获与之相互作用的prey，洗脱结合物之后可通过SDS-PAGE或Western blot分析，从而证实两种蛋白的相互作用或筛选prey。[2]
其中，bait和prey可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统及体外转录翻译系统等方法获得。
图片来源：
http://www.merrybio.com.cn/blog/gst-pull-down-introduction.html
实验思路：
制备并纯化bait-GST融合蛋白，获得结合bait-GST的磁珠；
制备prey protein（可选择His/Flag/HA/Myc等标签）；
使结合bait-GST的磁珠与含有Prey的溶液体外孵育。
实验难点及解决办法：
pull-down实验与其它很多蛋白互作方法一样，只要蛋白本身好表达，一般都很容易做出来。不过每个实验都有难搞的点。比如pull down实验可能最常见的困难就是洗不干净。反正只要按照pull down试剂盒，或者磁珠使用说明书、或者凝胶珠使用说明书来做，一般极难做出来，因为这些说明书上一般推荐洗两遍即可。我想做过的同学都懂~
一般大家现在做pull down都是采用磁珠（磁力架），凝胶珠（重力或者离心），Beads（重力或者离心）。但不管采用何种策略，原理和目的都是类似的。
针对洗不干净的原因
实验流程相对繁琐，洗杂次数难以估计。比如第一次洗5遍，洗不掉，第二次洗10遍，还是洗不掉，第三次洗20遍，可能都洗掉了。
蛋白量太大，生怕实验组不互作，所以多加蛋白，加的越多，越难洗掉。
最烦的是第一次失败之后，再来一次的痛苦。
综上，实际上没有把握该实验的精髓所在，做五次可能1个月没了。所以针对以上问题，我推荐如下解决方案供大家参考：
实验组和对照组蛋白量在保证差不多的情况下要尽可能减少蛋白量。
根据经验完成第一轮洗杂之后取部分样品进行WB检测，同时保留剩余样品（在四度放三五天一般问题不大），根据第一次WB的结果，再决定是否对剩余样品进行二次洗杂，相当于有了反悔机会；然后完成第二轮洗杂之后再取部分样品WB检测，直到获得理想的实验结果。
- 但需保证不论进行几轮洗杂，实验组和对照组要同等程度洗杂。
需要注意的问题
1.载体选择
现在基本上大多数常见标签的载体都能用于pull-down实验验证，比如GST，His，MBP等，具体选择哪些载体组合实际上还是看自己的蛋白在哪种载体上表达较好，具体还得多尝试。
GST标签载体
pGEX-4T-1（推荐）是目前构建GST融合蛋白最常用的原核表达载体之一。
图片来源：https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=pgex_vectors_(ge_healthcare)&plasmid=pGEX-4T-1
His标签载体
His标签载体往往选择性较多，常用的如pET系列载体，如pET15b，pET22b，pET28a，pET30a，pET32a（推荐）等。
图片来源：https://www.snapgene.com/plasmids/pet_and_duet_vectors_(novagen)/pET-32a(%2B)
- MBP标签载体
MBP标签载体最常用的应该是pMAL-p5x（推荐）载体，此外还有一些改造系列。
图片来源：https://www.snapgene.com/plasmids/basic_cloning_vectors/pMAL-p5X
2.表达感受态选择
一般常用BL21（DE3）感受态，但有时上述载体和BL21（DE3）组合出击可能表达效果一般，此时需要换载体或者换感受态摸索条件。
感受态的种类和载体的种类同样五花八门，尽管公司都标注了不同用途，但多数时候还是取决于蛋白本身因素。
3.蛋白表达受影响条件较多，需要不断探索
多数情况下，低温有利于增强蛋白的稳定性和正确折叠，易获得可溶性蛋白，而较高温度的诱导易使蛋白形成包涵体。
此外，还与诱导时间，IPTG浓度等有关。
Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 1988 Jul 15;67(1):31-40. doi: 10.1016/0378-1119(88)90005-4. PMID: 3047011. ↩︎
柴政斌,张更林,韩金祥.GST-pulldown技术在蛋白质相互作用中的应用[J].中国生物制品学杂志,2014,27(10):1354-1358. ↩︎
