一
前言
单细胞测序具有单细胞分辨率，但缺乏相应的空间背景信息，而Visium数据具有空间背景信息，但达不到真正的单细胞分辨率。目前单细胞和空间转录组相互弥补，常用的是通过转录本分布预测和细胞类型反卷积进行两者的联合分析，得到空间层面的细胞聚类结果，但是仍然缺乏在空间背景下准确的转录本在特定细胞中的定位信息。
Xenium基于多模态染色的方案，完美的在空间层面上将组织学和基因表达的数据定位在一张图谱中，展示出高复杂性、高通量、多模态的空间和细胞分辨率的数据。
二
研究背景
哺乳动物的大脑是通过一个复杂的空间线索相互作用而发育的，研究者们试图通过系统地描述整个时空范围内的细胞状态来理解大脑发育过程。这个过程涉及到由可扩散的形态素、细胞间相互作用以及内在的遗传程序产生的空间线索的复杂相互作用，可能导致超过一千种不同的细胞类型。为了全面理解这一过程，需要对大脑发育过程中的细胞状态进行全面的系统化描述。
2021年瑞典卡罗林斯卡学院Sten Linnarsson研究组与Gioele La Manno发表在Nature上的文章“Molecular architecture of the developing mouse brain”。文章中提到，单细胞RNA测序和空间转录组学在揭示复杂组织的分子异质性方面特别有力，尤其是在神经系统中。以前的研究探索了特定脑区的发育、整个成年大脑乃至整个胚胎的发育。本研究报道了一个小鼠胚胎大脑的全面单细胞转录组图谱，时间跨度从原肠胚形成到出生，确定了近八百种细胞状态，描述了大脑功能单元及其围膜的发育程序，包括早期神经上皮、区域特异性的次级组织者，以及神经发生性和胶质发生性祖细胞。
此外，研究者还使用原位mRNA测序来映射关键发育基因的空间表达模式，并将原位数据与单细胞聚类整合，揭示了神经系统模式形成过程中神经祖细胞的精确空间组织。
三
技术路线
本研究使用了妊娠期从胚胎日（E7）到E18.5的小鼠胚胎，共收集了45只怀孕母鼠的215个胚胎样本。
四
研究思路解读
针对胚胎日E7到E18之间胚胎期的小鼠大脑进行单细胞转录组测序，涵盖了小鼠大脑发育的关键时期，采用最新版本的Cytograph分析流程鉴定到了798个簇，识别了近800种不同的细胞状态，包括早期神经上皮、区域特异性的次级组织者、神经发生性和胶质发生性祖细胞；观察到与细胞周期激活相关的基因表达呈双峰分布，表明大量细胞处于细胞周期中。
通过原位测序技术，研究者们能够将单细胞数据映射到特定的解剖区域，揭示了神经祖细胞的空间分布。
单细胞转录组和原位杂交测序联合分析揭示细胞在发育过程中的空间分布和转录组变化，并对于特定的细胞类型（如神经母细胞和神经节神经母细胞），分析了它们的发育轨迹和基因表达模式。
最后通过原位杂交技术和转录组联合分析阐述神经元多样性的起源，放射状胶质细胞在空间和转录上都具有多样性，并分泌比以前认识到的更多的可扩散的形态形成物，为特定的神经元细胞类型提供精确的局部线索。
五
关键性研究结果
01
发育中小鼠全脑细胞图谱
经过单细胞数据结果分析，一共鉴定到798个大类，作者根据假定的主要细胞类别例如成纤维细胞、血管、免疫、胶质细胞、成胶质细胞、神经母细胞和神经元并对不同的细胞亚类、细胞表型和空间位置进行了手动标注和整理。细胞主要以胎龄进行分布，例如，作者发现在E7期细胞分离成原肠胚形成过程中产生的三个胚层；神经嵴在E8-E10期间形成，并在E10-E16期间分化为形成脑膜的成纤维细胞谱系。早期的神经管在E8形成，然后成熟为放射状胶质细胞。两大类神经元从神经管分支出来，一类包含前脑兴奋性神经元，另一类包含所有其他神经元类型。大约在E14之后，放射状胶质细胞逐渐失去增殖能力并转变为胶质母细胞状态，最终产生星形胶质细胞、室管膜和少突胶质细胞前体 (OPC) 细胞。
02
小鼠发育过程中神经系统中神经源性细胞向胶质细胞的转变
在胚胎发育过程中，作者从E7至E8.5阶段的细胞数据集中提取相应细胞，并针对原肠胚形成后期和早期神经胚层形成阶段的细胞进行了研究。作者根据聚类树状图将细胞分为五部分：包括原肠胚阶段的祖细胞（Pou5f1和T）、非神经谱系限制的祖细胞（Foxa2和Krt8）、早期神经上皮的祖细胞（Pax6和Hes3）等，并发现研究数据与先前描述的原肠胚单细胞图谱一致。作者进一步对神经上皮簇进行亚群分析，作者共鉴定出十个亚群，结果显示这些亚群差异性地表达与空间模式相关的基因。
除此之外，在原肠胚形成过程中，神经板的前后轴是通过一些外源信号建立的，而神经胚层形成后的大脑形态形成是由次级组织者发出的内在信号协调的。
根据聚类树状图还揭示了两个主要亚群：神经源性标记物表达的细胞和胶质标记物表达的细胞。这两组细胞之间有超过7,000个差异表达基因，且胶质母细胞优先表达与星形胶质细胞和少突胶质细胞相关的基因，并揭示出神经源性向胶质源性转变发生在E12和E16之间。
03
细胞类型和功能表型的空间转变
在大脑的发育过程中，不同的区域会根据它们特有的转录因子表达模式而形成。随着时间的推移，这些区域变得更加明确和细致。为了深入了解这一复杂的发育过程，并将其与细胞的转录活动联系起来，研究人员对处于发育阶段的小鼠E10.5胚胎进行了深入研究，具体来说，作者对24个矢状面切片中的119个基因进行了原位杂交测序。为了将单个细胞群体与它们在空间上的分布对应起来，研究人员采用了一种名为Tangram的计算方法。这种方法能够为每个细胞状态创建一个详细的空间定位图谱。通过这种方式，研究人员能够更精确地确定不同细胞群体在大脑发育过程中的具体位置。这种研究方法不仅揭示了大脑发育的复杂性，还为理解细胞如何在空间上组织起来提供了新的视角。通过将基因表达数据与空间信息相结合，研究人员能够构建出一幅更为完整的大脑发育图景。
大脑发育的一个核心问题是神经元多样性的起源。本文观察到，放射状胶质细胞在空间和转录上都具有多样性，并且多种分泌因子的存在为指定神经元细胞类型和命运提供了更为精确的局部线索。与此同时，本文只鉴定到87种放射状神经胶质细胞亚型，171种成神经细胞亚型和306种神经元亚型。但是作者发现存在放射状胶质细胞到神经节母细胞的转变：细胞周期停止后，剪接的活性显著增加并且出现了新的转录因子模块的表达。该转变过程在大多数谱系中保守存在。
总之，本文所建立的小鼠大脑发育过程细胞图谱提供了小鼠胚胎时期大脑转录组的多样性，而这是对哺乳动物神经系统发育研究的关键补充。
六
简言
Visium 和Xenium并不是“非此即彼”，而是相辅相成，通过Visium 来建立健康或疾病状态下的组织空间和基因图谱，然后采用为研究定制的Xenium基因panel进行更精细的研究机制拆解。
七
参考文献
[1]Lamanno, G., et al. Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature, 2021 Aug;596(7870):92-96.
关于联川
杭州联川生物致力于为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。
单细胞和空间转录组测序作为联川重点科研服务产品，目前已经搭建完成包括10x单细胞测序（ScRNA-seq、ScRNA-seq＆VDJ及ScATAC seq），10x空间转录组测序（Visium 、CytAssist），10x Xenium及华大时空组学（stomics）测序平台。联川生物实现从nm到um，从单细胞到亚细胞的全生态单细胞空间原位检测的布局。在样本制备和生物信息学分析，以及云分析平台方面充分发挥自身优势，联川生物致力于为客户提供优质的服务。
目前已经与多个国家及地区的100多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞和空间转录组测序相关的SCI高质量论文已超过百篇，影响因子平均15+，其中空间转录组相关文章数十篇（包含单细胞&空间转录组联合分析文章）。联川在单细胞&空间组学整合分析具备成熟的流程和云分析工具，对于数据挖掘和生物学故事具备深度的理解力，是值得信赖的多组学整合专家！
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