英文标题：Nondigestible stachyose binds membranous HSP90β on small intestinal epithelium to regulate the exosomal miRNAs: A new function and mechanism
发表期刊：Cell Metabolism
影响因子：27.7
发表时间：2024年11月
研究机构：陕西师范大学
涉及组学：外泌体miRNA测序、粪便miRNA测序、16s扩增子测序等
功能性低聚糖（FOs）长期以来被认为是不可消化的，能通过上消化道并直接到达远端结肠，被益生菌发酵。然而本文作者发现一类名为水苏糖的低聚糖能结合小肠上皮细胞（IECs）膜上的热休克蛋白 90b（HSP90b），影响了IECs分泌的外泌体中的miRNA。
CRISPR-Cas9介导的HSP90b敲除消除了水苏糖在细胞膜上的积累及其对这些miRNA的调节作用。水苏糖对这些miRNA的调节与其益生元作用无关，且已经出现改变的miRNA进一步塑造了肠道菌群，特别是小鼠体的乳酸杆菌。其中，水苏糖处理后在小鼠和人类粪便中miR-30a-5p的表达均出现下调，且能特异性抑制罗伊氏乳杆菌的生长。
本文的相关研究成果，首次建立了基于水苏糖-肠道-miRNA-肠道菌群的新调节轴，并揭示了低聚糖通过与细胞膜上HSP90b与肠上皮直接“对话”的未知新机制。
1、水苏糖直接与小肠IECs上的膜蛋白HSP90b互作
已知水苏糖在胃和肠道中不可消化，表明水苏糖无法进入小肠IECs。
通过荧光标记和共聚焦显微镜观察，无论是体外实验还是体内实验均证水苏糖明显富集在小肠上皮细胞的膜上。通水苏糖Pulldown实验正式，水苏糖与包括HSP90b在内的多种蛋白质有结合，且通过WB和分子对接进一步验证了水苏糖与HSP90b的直接结合，以及结合的稳定性。
2、水苏糖与细胞膜蛋白HSP90互作影响细胞外泌体中的miRNA表达
对MODE-K细胞外泌体进行miRNA测序，发现不同剂量的水苏糖处理会改变外泌体中的miRNA表达，且大多数miRNA呈现下调趋势。
如火山图显示，其中56条miRNA呈现高表达，占据整个外泌体中miRNA含量的87%。其中15条miRNA（miR-21a-3p、miR-186-5p、miR-199b-5p等）上调，26条miRNA（miR-30a-5p、miR-191-5p、miR-181a-5p等）响应水苏糖反应而下调。
通过siRNA沉默以及CRISPR-cas9方式正式水苏糖对MODE-K细胞外泌体的miRNA是通过与HSP90b互作来实现的。
总的来说，这些发现表明水苏糖通过靶向膜上的 HSP90β 来改变 MODE-K 细胞的外泌体中整体miRNA表达情况。
3、水苏糖重构小鼠和人类粪便中宿主IEC来源的miRNA
水苏糖处理后，小鼠小肠组织中40条差异表达的miRNA，在粪便样本中也有较大的差异表达趋势，这表明小肠外泌体种的miRNA可能被输送到肠道内容物中。
在不同剂量水苏糖处理的小鼠粪便中，miRNA表达谱存在明显差异，且通过相关分析确定了一些高表达且差异显著的miRNA。在人为干预研究中，水苏糖重塑了人类粪便中的miRNA，且确定了一些高表达的miRNA。
作者发现小鼠和人类粪便中存在23种共同的高表达miRNA，其中miR-30a-5p在两者中均呈下调趋势。
4、水苏糖改变粪便miRNA促进乳酸杆菌生长以重塑造肠道菌群
在小鼠实验中，水苏糖改变了肠道微生物结构，导致多种菌群的丰度发生变化，其中乳酸杆菌的丰度出现上调。
通过剂量依赖性实验和16s测序，进一步明确了水苏糖对肠道微生物组成的影响，不同剂量的水苏糖处理后的小鼠肠道菌群结构会有所不同。
在人体实验中，水苏糖也使肠道菌群的组成成分发生变化，乳酸杆菌的相对丰度显著增加。令人惊讶的是，在消除肠道细菌后，水苏糖仍然改变了粪便中宿主miRNA的组成。
其中miR-30家族出现了显着的变化，miR-30a-5p响应水苏糖表现出最显着的下调倍数变化。
通过无菌小鼠模型和粪便miRNA移植实验表明，排除了水苏糖对粪便miRNA的影响依赖于其益生元作用的可能性，验证了水苏糖对粪便miRNA的直接调节作用以及粪便miRNA对肠道菌群的塑造作用。其中，Dubosiella、Clostridium和Lactobacillus在接受水苏糖后表现出与正常小鼠相同的变化趋势。
对相关miRNA靶基因进行了GO和KEGG富集分析，发现核糖体、氧化磷酸化、糖酵解在内相关通路基因与细菌基因翻译和能量代谢相关。此外脂肪酸（丙酸和丙酮酸）代谢途径对于肠道稳态至关重要。
因此，作者建立了水苏糖-外泌体miRNA-肠道菌群的调节轴，并验证了乳杆菌是关键的水苏糖反应性肠道微生物之一。
5、水苏糖下调的miR-30a-5p和miR-133b-3p抑制乳酸杆菌的增殖
通过线性拟合分析，发现miR-30a-5p与乳酸杆菌的相对丰度有显著相关性，且miR-30a-5p在水苏糖处理的多种样本中均呈下调趋势，推测其可能是靶向乳酸杆菌的Candidate miRNA。
通过体外培养实验，发现miR-30a-5p和miR-191-5p能进入罗伊氏乳杆菌，且miR-30a-5p能显著抑制其生长，而miR-191-5p的抑制作用较弱，同时通过序列比对和实验验证了miR-30a-5p对罗伊氏乳杆菌的靶向作用是序列特异性的。
此外，通过实验还发现miR-133b-3p能进入加氏乳杆菌并抑制其生长。
6、水苏糖改变的肠道微生物群与粪便miRNA之间存在负反馈回路
通过粪便移植实验，发现接受水苏糖改变的粪便miRNA和细菌的小鼠肠道微生物群结构与其他组不同，且乳酸杆菌的相对丰度增加程度较低，表明水苏糖改变的肠道微生物群可能会反过来阻碍乳酸杆菌的增殖。
通过体外培养实验，发现水苏糖改变的粪便微生物群的代谢产物能抑制加氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的生长，与体内结果一致。
通过对接受不同处理的小鼠粪便中miRNA测序结果进行分析，发现水苏糖塑造的肠道微生物群对粪便miRNA也有影响，存在负反馈调节。
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