通过综合代谢组学和宏基因组学研究低盐豆辣椒酱的风味形成特征

英文标题：Characterizing flavor development in low-salt Chinese horse bean-chili paste through integrated metabolomics and metagenomics

发表期刊：Food Chemistry

发表时间：2025年1月

研究机构：四川大学生物科学与工程学院

涉及组学：宏基因组测序、代谢组

本研究利用代谢组学和宏基因组学研究了低盐和高盐豆辣椒酱（CHCPs）的微生物组成和功能。结果表明，共鉴定出25种关键代谢物来区分两种样品的风味属性。低盐CHCP中Leuconostoc为优势菌群，而高盐CHCP中Pantoea为优势菌群。与传统的高盐发酵相比，低盐和接种发酵促进了Companionlactobacillus、Levilactobacillus、Tetragenococcus、Zygosaccharomyces和Wickerhamiella的相对丰度的增加，以及碳水化合物和氨基酸代谢途径的丰富，从而增强了特色风味化合物。进一步的代谢途径重建阐明了与关键代谢物形成相关的21个潜在微生物属，如Leuconostoc、Levilactobacillus、Pantoea和Pectobacterium。本研究可为优化低盐豆辣椒酱及同类发酵产品的发酵工艺，提高其风味品质提供参考。

总体而言，在所有样本中检测到167种挥发性代谢物（VMs）。与高盐发酵批次相比，低盐发酵批次的挥发性代谢物总含量显著增加，尤其是醇类和酚类，发酵90天后分别增加了74.29%和302.91%。此外，PCA分析显示，在初始发酵阶段（D0-D30），低盐发酵批次的挥发性代谢物比高盐发酵批次发生了更显著的变化，最终形成了独特的风味特征。随后，OPLS-DA模型在不同发酵批次的挥发性代谢物中表现出明显的聚类和明显的分离，每个模型的R²和Q²值都在0.9以上。通过200次排列试验进一步证实了模型识别可识别标记的有效性，结果表明，分别有34、28、22和19种挥发性代谢物（VIP > 1, P < 0.05, |FC|≥1）分别在发酵0、30、60和90天显著有助于区分低盐和高盐批次的样品。同时，有30种挥发性代谢物被认为在批次之间具有香气贡献作用，这与之前对郫县豆瓣的研究一致。综合统计分析显示，有17种关键挥发性代谢物的香气贡献在批次之间存在显著差异（VIP >, P < 0.05, |FC|≥1,ROAV > 1）。其中，在D0时，3-辛酮，α-松油醇，α-蒎烯和β-茶树烯被确定为区分低盐发酵和高盐发酵的关键挥发性代谢物。在D30时，2-甲基丁醛成为区分两组的关键挥发性代谢物。从0到60天，苯乙醛、芳樟醇和辛酸乙酯起关键作用，而从D30到D60，乙酸乙酯被确定为两组差异的重要贡献者。4-乙愈创木酚、苯乙醇、1-辛醇和2-辛酮是导致两组患者在D30至D90阶段差异的重要因素。在整个时期（D0-D90）， 4-乙基苯酚、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-丁酸和2,3-丁二醇成为区分低盐发酵和高盐发酵的关键挥发性代谢物。

共检测到24种非挥发性代谢物（NVMs），包括7种有机酸（OAs）和17种游离氨基酸（FAAs），它们在发酵过程中的进化规律不同。高盐发酵批次的OAs含量不断下降，低盐发酵批次的发酵过程中OAs含量和FAAs含量出现了一定的波动。值得注意的是，发酵结束时FAAs含量显著上升，低盐发酵批次D90样品（16.79 mg/g）比高盐发酵批次D90样品（11.03 mg/g）高出52.23%。这些结果表明，高盐环境下微生物活性的抑制，降低了微生物分泌蛋白酶的能力。相反，在低盐和微生物干扰条件下，发酵系统中微生物群落的复杂性和多样性对OA和FAA含量有显著影响。非挥发性代谢物的PCA结果与挥发性代谢物相似，其中后期的样本差异更大。然后，使用随机森林分析，获得具有显著差异的非挥发性代谢物，筛选出15个标记（RF > 3%）。同时，有12个味觉属性值（TAV）大于1的非挥发性代谢物被鉴定出来，这表明这些化合物在豆辣椒酱的味觉特征中起着重要作用。因此，我们结合RF和TAV确定了影响高盐发酵和低盐发酵样品口味特征的关键非挥发性代谢物，并过滤筛选出8个关键非挥发性代谢物，即草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸。

分析了排名前20位的细菌和真菌属和种。在属水平上，尽管两组具有相似的优势微生物组成，但低盐和接种发酵显著影响了豆辣椒酱中微生物群落的丰度。其中，Leuconostoc菌群在低盐发酵批次中占优势，而Pantoea菌群在高盐发酵批次中占优势。此外，低盐发酵批次的Companilactobacillus（18.16%）和Levilactobacillus（7.21%）的平均相对丰度显著高于高盐发酵批次（分别为2.71%和0.27%）。Weissella、Staphylococcus和Zygosaccharomyces此前被确定为传统豆辣椒酱混合发酵阶段的优势微生物。在盐还原和生物干扰的双重作用下，前两种批次的相对丰度显著降低，而低盐发酵批次的相对丰度显著升高。此外，由于接种发酵，在低盐发酵批次中，Tetragenococcus和Wickerhamiella的相对丰度显著增加，而在高盐发酵批次中，相对丰度较低且趋势相对稳定。先前的研究表明，Tetragenococcus halophilus、Zygosaccharomyces rouxii和Candida versatilis作为发酵剂用于强化豆辣椒酱发酵时，在强化底物中表现出有限的存活能力。因此，在低盐发酵批次中观察到的丰度升高可能归因于最佳生长盐度，这一结论已在先前的研究中得到证实。此外，作者还观察到，与高盐发酵批次相比，低盐发酵批次中Enterobacter、Lactiplantibacillus、Lactococcus、Kluyvera、Kosakonia、Klebsiella、Nakaseomyces和Pseudomonas的总相对丰度显著降低。其中Enterobacter、Kosakonia、Klebsiella和Pseudomonas是潜在的腐败微生物，它们的存在可能导致产品变质。这些属丰度的下降可能是由于低盐发酵批次的pH值降低，而Leuconostoc分泌的细菌素可以进一步抑制这些腐败菌群的生长，最终确保低盐豆辣椒酱的安全性。在种水平上，优势种也发生了相应的显著变化。高盐发酵批次的主要优势种为Pantoea agglomerans，低盐发酵批次的主要优势种为Leuconostoc citreum和Companilactobacillus futsaii。虽然两组中Pichia kudriavzevii均占显著优势，但低盐发酵批次的代谢活性较弱。

通过与KEGG数据库的对比，所有微生物基因被划分为3个水平的代谢途径，在KEGG Level1水平鉴定出6个代谢子系统，其中“代谢”类基因数量最多，分别占低盐发酵批次和高盐发酵批次所有途径的67.15%和67.11%。因此，我们进一步对这一代表性类别在KEGG Level3水平下的前三大代谢途径（即氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢）进行综合分析。与高盐发酵批次相比，低盐发酵批次发酵过程中几乎所有碳水化合物相关代谢途径的比例都有所增加，包括糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和戊糖磷酸途径。糖酵解和糖异生是基本的能量产生过程，这表明微生物细胞可能通过增强其能量产生机制来适应低盐环境，以补偿低盐浓度引起的渗透压降低和潜在应激。这种增强的能量生产不仅可以维持微生物的生长，还可以促进次生代谢物的生物合成，包括风味化合物。此外，低盐接种发酵促进了典型的氨基酸代谢（如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、赖氨酸生物合成、酪氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解）和脂质代谢（包括脂肪酸和不饱和脂肪酸生物合成、甘油脂和甘油磷脂代谢、酮体合成和降解）。氨基酸代谢途径的增强，表明微生物细胞合成和修饰这些氨基酸的能力增强，可能导致产生更广泛的挥发性化合物，如醛、酮和酯。此外，由于与碳水化合物代谢相关的基因丰度最高，基于CAZy数据库揭示了不同批次微生物群利用碳水化合物能力的差异。结果表明，糖基活性酶主要集中在糖基结合模块（CBMs）、糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）和糖基酯酶（CEs）上，其丰度在低盐发酵批次（245.35、2188.01、1406.47、101.09）明显高于高盐发酵批次（226.101、1536.12、1244.34、62.17）。

25个关键代谢物（17个挥发性代谢物和8个非挥发性代谢物）与40个主要属的关系采用Spearman相关性（|ρ| > 0.7和P < 0.05）进行分析，并通过热图进行可视化。Tetragenococcus、Levilactobacillus、Wickerhamiella和Zygosaccharomyces与最多数量的关键代谢物呈显著正相关，分别为11、8、8和8个。此外，Starmerella、Leclercia、Companilactobacillus、Leuconostoc、Aspergillus、Paraglomus和Pectobacterium分别与5、5、4、4、3、3和3个关键代谢物呈正相关。风味特性受微生物群落内部相互作用的显著影响。因此，作者构建了优势微生物群之间的共现网络（|r| > 0.7和P < 0.05），并根据节点数、边数和度来评估这些网络的复杂性。在高盐发酵和低盐发酵批次中分别有115条边（58条正相关，57条负相关）和434条边（335条正相关，99条负相关）。值得注意的是，低盐发酵批次中特征代谢物的富集与微生物之间合作和互动关系的复杂性增加密切相关。此外，许多风味贡献微生物，如Wickerhamomyces、Weissella、Pseudomonas、Pectobacterium、Lactococcus和Pichia在低盐发酵批次中与其他微生物表现出更强的合作和共生关系。此外，我们的观察显示，在高盐发酵批次中，Tetragenococcus与任何其他微生物没有任何显著的相关性，而Wickerhamiella与Companilactobacillus表现出共生关系。Starmerella和Leuconostoc并与其他10种微生物表现出竞争性相互作用。相反，在低盐发酵批次中观察到相关性的变化。Tetragenococcus与Levilactobacillus、Wickerhamiella呈正相关，同时Wickerhamiella与Levilactobacillus、Lactiplantibacillus、Mammaliicoccus、Tetragenococcus呈正相关。这些结果表明，在低盐环境下，发酵剂与其他微生物之间的相互作用关系发生了改变，这可能有助于某些特征风味化合物的产生。

基于KEGG数据库，鉴定出21个优势菌群和68个与底物降解和风味生物合成相关的酶。在豆辣椒酱发酵过程中，Lactobacillales、Mucorales和Eurotiales是多糖的主要利用者，其降解产物葡萄糖与蔗糖和其他单糖一起是许多其他类群的主要碳源。有机酸显著影响豆辣椒酱产品的独特酸度、口味和风味，乳酸和乙酸是主要影响因素。Leuconostoc、Weissella、Staphylococcus、Lactococcus和Tetragenococcus等微生物群携带了丙酮酸转化为乳酸所必需的基因组，包括l-乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）和d-乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.28）。Pectobacterium、Pseudomonas和Klebsiella具有利用丙酮酸脱氢酶（EC 1.2.4.1和EC 1.2.5.1）和醋酸-辅酶a连接酶（EC 6.2.1.1）产生乙酸的能力。此外，Pantoea、Enterobacter、Acinetobacter和Staphylococcus的基因组分别编码用于将乙酸转化为乙醛和乙醇的醛脱氢酶（NAD+）（EC 1.2.1.3）和乙醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）。这些生物之间的动态相互作用可能解释了豆辣椒酱发酵过程中乙酸水平的波动。值得注意的是，Pantoea、Enterobacter、Klebsiella和Staphylococcus基因组中显著的草酸（乙基氧酸氧化酶EC 1.2.3.5）、柠檬酸（柠檬酸合成酶EC 2.3.3.1）和琥珀酸（琥珀酰辅酶a合成酶EC 6.2.1.5）的生产和利用基因。这些酶在低盐和高盐批次中的差异表达导致了不同水平的草酸、柠檬酸和琥珀酸。天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和组氨酸是豆辣椒酱的主要氨基酸，它们构成了豆辣椒酱的鲜味、甜味和苦味。

以上就是本次文献解读分享，在这里我们了解到低盐和高盐豆辣椒酱发酵过程中代谢物和微生物群落的变化，从中发现了低盐接种发酵过程会显著重塑了微生物群落结构，在此过程中，碳水化合物和氨基酸代谢途径显著增强，其中Pectobacterium在其中起关键作用。此外，低盐发酵中特征风味化合物水平的升高与复杂的微生物相互作用密切相关，特别是为微生物之间的共生关系直接促进了风味的发展，形成了风味形成的重要基础。与此同时，与发酵剂相比，优势微生物对风味化合物的产生有更高程度的贡献。未来的研究可结合多组学技术，更加全面的揭示豆辣椒酱发酵过程中风味的形成机制。

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