国自然2025：单细胞+bulk转录组如何开展研究？|生信开发实战

    Bulk RNA-seq技术是一种广泛用于转录组分析的技术，用于研究转录结构、剪接模式以及基因和转录本表达水平。与当前大火的单细胞测序不同，bulk RNA-seq是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA进行测序，能够得到的是一群细胞的转录组的平均数据，或者说是代表性数据，细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖。而单细胞测序是一种在单个细胞水平上，运用高通量测序技术对细胞内的基因组、转录组、表观基因组等遗传信息进行检测和分析的前沿技术手段，能够解决bulk测序无法解决的细胞异质性问题，对于推进医学和生物学研究进展具有极大的促进作用。

    相比于传统的bulk RNA-seq，单细胞转录组测序（scRNA-seq）在分辨率方面取得了重大突破，可以将基因表达量检测的分辨率提高到单个细胞精度。但是由于RNA的捕获和扩增上仍然存在一些局限性，使得单细胞转录组测序在整体RNA的覆盖和测序深度方面与bulk RNA-seq相比存在一定差距，这种技术上的不同为这两种方法各自塑造了特定的应用领域。

星云（单细胞云分析平台）分析框架图

    单细胞转录组测序更倾向于深入探讨细胞的内部机制，侧重于从细胞类型这个角度出发，对分子机制进行阐释，为我们揭示了基因表达的微观世界，帮助研究者深入理解细胞分化、细胞间的继承关系以及如何从细胞的视角去看待分子过程。而bulk RNA-seq，更像是一个宏观的观察工具，它把焦点放在了基因的整体行为上。通过它，研究者可以深入研究非编码RNA的功能、RNA的可变剪切模式、甚至是复杂的基因调控网络，这有助于我们从宏观的角度去探索基因的变化是如何影响生物体的表型的。

沧海（有参转录组云分析平台）分析导航图

单细胞转录组测序和bulk RNA-seq都是依托于NGS的测序手段，两者从不同角度提供了理解生命的机制的途径，各有其独特之处。基于scRNA-seq和bulk RNA-seq形成的细胞与基因上的互补，两者不仅可以相互并行印证，也可以在研究中互为上下游的关系，为生物学研究带来了更多的可能性。

    单细胞转录组和bulk RNA-seq形成的细胞与基因上的互补，主要的联合分析路线包含肩并肩和上下游。肩并肩是并行分析，基于某个节点进行细胞与基因的链接，而上下游则是将某一个组学作为基于另一个组学核心挖掘结果的下一步深入探索的工具，比如更深入的分子机制，而不是生物学意义上的上下游，比如细胞信号转导。

    （1）肩并肩-1：Bicluster整合bulk RNA-seq差异基因与scRNA-seq细胞亚群

    （2）肩并肩-2：bulk RNA-seq与scRNA-seq并行聚焦候选基因

    （3）肩并肩-3：scRNA-seq与bulk RNA-seq反卷积并行印证

    上下游：单细胞目标细胞亚群 + 流式分选bulk RNA-seq深挖基因调控网络

    就像做完转录组测序以后要对选定的基因进行qPCR验证一样，单细胞测序分析结果，特别是细胞cluster构成，比如利用bulk RNA-seq数据分析样本细胞构成（比如二次规划算法，反卷积算法），或者对目标细胞亚群进行基因表达模式与相关分子机制的研究。

案例1、甲状腺乳头状癌发生和发展的肿瘤生态系统的单细胞转录组学分析

 文献信息

标题：Single-cell transcriptomic analysis of the tumor ecosystems underlying initiation and progression of papillary thyroid carcinoma

期刊名：Nature Communications

影响因子：17.649

发表时间：2021年

研究背景

    在过去的40年里，美国甲状腺癌的发病率以每年3%的速度增长，其中大部分是由于乳头状甲状腺癌（PTC）增多所致。虽然大多数PTC的临床过程缓慢，但其中一些在诊断时已发展为局部区域甚至远处转移性疾病。手术、放射性碘 (RAI) 消融和促甲状腺激素 (TSH) 抑制相结合治疗仍可使大多数病例获得良好的预后，而一部分患者最终会进展为RAI难治性 (RAIR) 状态甚至死于该疾病，这些患者可能是分子靶向抑制剂和免疫疗法等替代疗法的潜在候选人。本文解读了PTC生态系统，提示其潜在的预后和治疗意义。

数据来源与测序样本

    对来自11名乳头状甲状腺癌（PTC）患者的4种组织（癌旁组织、原发/进展肿瘤、初次治疗/复发淋巴结和放射性碘难治性远处转移灶进行单细胞测序，共得到158577个细胞，涵盖了PTC的全面临床过程。

    613例样本的bulk RNA-seq数据来源于TCGA和PRJEB11591。

癌前甲状腺细胞的鉴定和转录特征

PTC的分子亚型和bulk RNA-seq图谱的反卷积

    1、利用TCGA的bulk-seq数据和文章scRNA-seq构建的PTC机器学习分类器，并应用与scRNA-seq分析中的肿瘤鉴定。单细胞分辨率下确定了22个与TDS评分（甲状腺分化评分，一种广泛用于评估PTC分化状态的算法）显著正相关的基因。其中，8个基因（MT1F、SORBS2、MT1G、SORD、SLC26A4-AS1、PRDX1、FCGBP、MATN2）尚未被报道参与甲状腺分化。

    2、根据肿瘤鉴定结果，得到肿瘤相关差异基因，发现TMSB4X（在PTC中尚未报道）在恶性细胞中显著上调，而非恶性细胞中则不然。并且从原发性癌细胞到LN转移性细胞的TMSB4X表达模式也呈增加趋势。在Bulk-seq数据集中验证了相关结果，TCGA和PRJEB11591队列均验证了从肿瘤旁到N0期肿瘤再到N1期肿瘤的TMSB4X表达在总体概况中的增量趋势。免疫组织化学（IHC）染色还显示，在另外两例病例（经典PTC和FV-PTC）中，肿瘤细胞上的TMSB4X表达明显高于其相邻的正常甲状腺细胞。综合表明TMSB4X是一种可能参与PTC发生和进展的提示性生物标志物。 

    3、根据肿瘤鉴定结果，鉴定480个甲状腺上皮细胞伪时间相关基因（PAGs），即癌症分化或进展相关基因，并基于PAG对PTC患者进行BRAF-/RAS-like精确分型，并检验精确分型的效果。

    4、对bulk RNA-seq数据进行反卷积分析，对单细胞数据中鉴定出的多种细胞亚群比例进行量化，并与单细胞数据中细胞亚群比例进行对比，即互相验证。

案例2、单细胞和bulk转录组的平行分析揭示胃肿瘤微环境的关键特征

文献信息

标题：Parallel single-cell and bulk transcriptome analyses reveal key features of the gastric tumor microenvironment

期刊名：Genome Biology

影响因子：17.906

发表时间：2022年

研究背景

    肿瘤微环境（TME）已被证实对各种癌症患者的治疗结果有重大影响，并且影响总体生存率。然而，胃癌中形成TME的细胞尚未得到广泛的表征。

数据来源与测序样本

    24例未接受治疗的胃癌患者的肿瘤和匹配的正常组织的bulk和单细胞RNA测序。

    407例样本的bulk-seq数据来源于TCGA-STAD。

癌症相关成纤维细胞中的转录重编程

bulk和单细胞RNA-seq整合

    1、利用genesorteR R包整合bulk-seq和scRNA-seq数据，分析实验组与对照组间存在的转录差异，并与肿瘤样本bulk-seq的生存率进行相关性分析相关。

    2、分析细胞亚群的特征基因在两亚群间、样本中的表达差异情况，分析目标特征基因与病人生存率的关系，发现抗炎特征的表达与TCGA胃癌队列中的生存率降低显著相关，而通过CIBERSORTx对bulk RNA-seq样本进行反卷积确定的相应巨噬细胞群的丰度则不能预测结果。

    3、以scRNA-seq数据为参考，使用CibersortX对TCGA队列样本bulk-seq数据进行反卷积，分析其中不同细胞亚型占比，并评估不同细胞亚型的对病人生存差异的影响。肿瘤相关细胞亚型F13- CTHRC1和EN10- SERPINE1比例较高的患者生存时间显著缩短。几种内皮细胞和上皮细胞亚型也对胃癌患者生存表现出显著的负面影响，表明它们可能与胃癌进展有关。相反，cDC1树突状细胞 (M16-cDC- CLEC9A ) 的比例对患者生存有显著的积极影响。

案例3、单细胞RNA测序与bulk RNA测序分析相结合揭示胃癌的诊断和预后特征以及免疫浸润

文献信息

标题：Single-cell RNA sequencing integrated with bulk RNA sequencing analysis reveals diagnostic and prognostic signatures and immunoinfiltration in gastric cancer

期刊名：Computers in Biology and Medicine

影响因子：7.7

发表时间：2023年7月

研究背景

    胃癌（GC）的早期诊断和预后预测对当前GC临床治疗实践提出了重大挑战。因此，探索可以预测GC患者预后的相关基因特征具有重要意义。

数据来源与测序样本

    5名患者的原发肿瘤组织和正常组织共10个配对样本的单细胞测序。

    32个正常样本和375个肿瘤样本的bulk-seq数据来源于TCGA-STAD。

    483个肿瘤样本的bulk-seq数据来源于GEO数据库GSE84437数据集。

scRNA -seq中T细胞的单细胞转录组图谱

T细胞中预后基因特征的预测和验证

T细胞和免疫细胞中预后特征之间的相关性分析

T细胞中预后基因特征的免疫浸润分析

    1、T细胞相关的免疫应答在GC的TME中起重要作用，GC scRNA-seq图谱表明所有样本中都存在大量T细胞。因此，从后续分析的18416个高质量细胞中提取了3284个T细胞，用于随后的聚类和注释。T细胞聚类后的7个T细胞亚群，包括763个记忆CD8 T细胞，426个粘膜相关不变T（MAIT）细胞，297个调节性T细胞，1017个T辅助细胞1/17（Th1/17）和781个Vδ2 T细胞。

    2、对TCGA-STAD数据集进行了差异基因分析，并将得到的1494个DEGs与scRNA-seq中的641个T细胞相关DEGs进行了交叉，得到了10个交叉基因（MAL、HOPX、ARL4D、GKN1、HBB、CLIC3、GPR15、HPGD、MZB1和GBP5）。

    3、对交叉基因的表达矩阵进行标准化，然后采用LASSO回归分析法计算其风险评分。以TCGA-STAD数据集为训练集，以GSE84437数据集为测试集，建立了预后模型。根据风险评分将患者分为高风险组和低风险组。生存曲线显示，训练集和测试集的高风险组预后较差。随时间变化的ROC曲线分析表明，预后特征在预测训练集和测试集的患者总生存率方面表现良好。随后，生成气泡图显示10个预后特征在scRNA-seq中的表达情况。

    4、分析了这10个预后特征与22种免疫细胞类型之间的相关性，发现GBP5与多种T细胞亚群之间存在很强的相关性。

    5、进一步探讨高危患者组和低危患者组的预后特征与TME之间的关系。使用CIBERSORT算法对22种免疫细胞类型的比例进行了可视化分析。随后，在风险分层的基础上，利用ESTIMATE算法计算了患者的免疫评分。结果显示，高风险组的基质评分更高，而低风险组的免疫评分更高。此外，还采用ssGSEA算法分析了高危和低危患者组中免疫细胞的比例。分析表明，低风险组的CD8 T细胞、活化记忆CD4 T细胞、T滤泡辅助细胞、γδ T细胞和M1巨噬细胞的比例较高。相比之下，高危组的静息记忆CD4 T细胞、单核细胞、静息肥大细胞和幼稚B细胞比例更高。这些研究结果表明，与高危组相比，低危组患者拥有更高比例的具有抗肿瘤活性的免疫细胞，这表明免疫浸润在肿瘤发生发展过程中起着主要作用。

总之，可以借助于单细胞转录组与bulk RNA-seq分别在细胞类型与组成解析、细胞互作、细胞分化、基因表达调控网络与分析机制解析上的优势互补，可以帮助我们更好的去探究生物学问题到细胞水平与基因水平。但需要注意的是无论是肩并肩还是上下游的联合分析方案，都需要对其中一个组学进行一定的挖掘后选择有生物学意义的或感兴趣的部分才能进行有效联合分析，而没有一个统一的全流程范式的分析内容。从这一点上来说，如果您需要对两个组学进行联合分析，可以基于您的数据情况与感兴趣的内容与我们的技术工程师团队进行沟通交流，以确定对应的分析方案，获得更有价值的联合分析结果，而更多关于联合分析的内容可以观看我们的直播回放。

【1】Pu W, Shi X, Yu P, Zhang M, Liu Z, Tan L, Han P, Wang Y, Ji D, Gan H, Wei W, Lu Z, Qu N, Hu J, Hu X, Luo Z, Li H, Ji Q, Wang J, Zhang X, Wang YL. Single-cell transcriptomic analysis of the tumor ecosystems underlying initiation and progression of papillary thyroid carcinoma. Nat Commun. 2021 Oct 18;12(1):6058. doi: 10.1038/s41467-021-26343-3. PMID: 34663816; PMCID: PMC8523550.

【2】Kang B, Camps J, Fan B, Jiang H, Ibrahim MM, Hu X, Qin S, Kirchhoff D, Chiang DY, Wang S, Ye Y, Shen Z, Bu Z, Zhang Z, Roider HG. Parallel single-cell and bulk transcriptome analyses reveal key features of the gastric tumor microenvironment. Genome Biol. 2022 Dec 22;23(1):265. doi: 10.1186/s13059-022-02828-2. PMID: 36550535; PMCID: PMC9773611.

【3】Zhai Y, Zhang J, Huang Z, Shi R, Guo F, Zhang F, Chen M, Gao Y, Tao X, Jin Z, Guo S, Lin Y, Ye P, Wu J. Single-cell RNA sequencing integrated with bulk RNA sequencing analysis reveals diagnostic and prognostic signatures and immunoinfiltration in gastric cancer. Comput Biol Med. 2023 Sep;163:107239. doi: 10.1016/j.compbiomed.2023.107239. Epub 2023 Jul 9. PMID: 37450965.

单细胞评分分析R包Ucell
单细胞细胞通讯分析之CellChat v2
空间转录组细胞注释软件之Cell2location |生信开发实战