DNA甲基化修饰研究思路——备战国自然2025

(最近国自然部分中标项目)

(源自pubmed数据截止2024.12.16)

近几年关于DNA甲基化的论文发表数量巨大，2024年已发文约6300余篇。

而DNA甲基化研究一直以来都是顶级期刊、基金资助、临床研究、药物研发上市的多重热点。并且作为表观遗传学的重要组成部分，近年来在基因表达调控和疾病机理研究中的关注度持续升高。

那什么是DNA甲基化呢，他就是DNA序列上特定的碱基在DNA甲基化转移酶（DNMT）的作用下，通过共价键结合的形式获得一个甲基基团的过程，5mC 通过双加氧酶（TETs）氧化生成5hmC，5hmC是DNA去甲基化的中间产物，也被称为“第六碱基”TETs酶还可以将5hmC进一步氧化生成5-甲酰胞嘧（5fC）和 5-羧基胞嘧啶（5caC），上述产物都是去甲基化过程中的表观遗传修饰，同时也调控DNA去甲基化的进程。DNA 5mC/5hmC作为表观遗传学修饰的重要机制，是表观遗传修饰领域的研究热点。同时在多种生物学行为和个体生长发育环节发挥着重要的作用，受到众多研究者的追捧和青睐，并在肿瘤检测中逐渐被应用。

从DNA甲基化调控模型上来看，有以上三种调控方式；

①DNA甲基化调控经典模型：甲基化CpG岛启动子招募转录抑制性MBD蛋白并阻止转录因子结合，而非甲基化的CpG岛被转录因子结合。

② DNA甲基化对转录调控的新模型：带有甲基化CpG岛启动子的基因被含有MBD的抑制性复合物抑制。此外增强子甲基化可以阻断转录因子的结合。大多数具有非甲基化CpG岛启动子的活性基因都与含CXXC结构域的激活子复合物结合。此外，转录因子与非甲基增强子结合。最后，活性基因的gene body高度甲基化，这有助于抑制隐性转录。

③DNA甲基化与转录起始抑制之间的解耦。在某些情况下，一些低密度CpG甲基化启动子被积极转录。转录抑制性MBD蛋白不与这些启动子相互作用，原因未知。此外，一些低密度CpG的DNA序列（包括增强子和启动子）可以通过激活转录因子结合。H3K4me3就是一种与主动转录相关的启动子相关组蛋白标记

人及小鼠等基础医学和细胞生物学推荐综述：

✦DNA methylation in mammalian development and disease. Nat Rev Genet. 2024

✦DNA methylation: old dog, new tricks? Nat Struct Mol Biol. 2014, 21(11): 949

植物方向推荐综述：

✦Epigenetic gene regulation in plants and its potential applications in crop improvement. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024

✦Non-canonical RNA-directed DNA methylation. Nat Plants. 2016, 2(11): 16163

目前联川所能提供的检测服务包括WGBS，RRBS，EM-seq，甲基化芯片等，在前面的推文中我们也详细对比了各个技术的特点以及应用场景的区别，例如WGBS是使用重亚硫酸盐在全基因组层面找寻甲基化位点，但是盐转的方式可能会造成部分的DNA损伤，RRBS通过双酶切使用MspI以及ApeKI富集高甲基化CPG位点的方式，有效提升DNA甲基化的覆盖度和准确性，对于EM-SEQ则是通过酶转的方式尤其适用于一些植物样本或者DNA初始含量不高的样本适用，那对于芯片来说做群体队列则是更加稳定，经济实惠的检出方式。更多详细的内容各位老师可以点击下方链接了解更多。DNA甲基化技术该如何选择，这篇文章告诉你答案

在进行甲基化差异水平分析时重点筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组TE元件上的分布（影响基因组稳定性Promoter：影响基因表达Genebody）、DMC/DMR的TF结合分析（主要关注Promoter和Enhancer等调控区域DMC/DMR的TF结合位点。）、时序甲基化数据的分析策略（比较相邻时间点的差异直接筛选时间阶段相关的DMC和DMR）、DMG的功能分析等。

①生物标志物开发

许多疾病的发生发展与特定基因的DNA甲基化状态改变密切相关。可以通过对不同疾病状态下的组织、细胞或体液样本进行DNA甲基化分析，筛选出具有特异性的甲基化位点或模式，作为疾病诊断的生物标志物。

②早期诊断和筛查

DNA甲基化的变化往往发生在疾病的早期阶段，甚至在临床症状出现之前。因此，通过检测特定基因的DNA甲基化状态可以实现疾病的早期诊断和筛查。

例如：在肿瘤诊断中，某些肿瘤抑制基因的启动子区域高甲基化可能导致基因沉默，从而促进肿瘤的发生，检测这些基因的甲基化状态可以为肿瘤的早期诊断提供重要线索。

③疾病分型和预后评估

不同类型的疾病或同一疾病的不同亚型可能具有不同的DNA甲基化特征。通过对疾病样本进行全面的DNA甲基化分析，可以对疾病进行分型，为个性化治疗提供依据。

此外，DNA甲基化状态还可以作为疾病预后的评估指标。某些基因的甲基化水平与疾病的进展、复发风险或患者的生存率相关，可用于预测疾病的发展趋势。

①基因表达调控研究。

DNA甲基化是一种重要的基因表达调控机制。通过研究DNA甲基化对基因表达的影响，可以深入了解基因调控网络的复杂性。

例如：可以利用基因编辑技术或药物干预等手段，改变特定基因的DNA甲基化状态，观察其对基因表达和细胞功能的影响，从而揭示DNA甲基化在基因表达调控中的具体作用机制。

②发育生物学研究

在胚胎发育过程中，DNA甲基化状态会发生动态变化，调控着不同阶段的基因表达。研究胚胎发育过程，以及衰老中的DNA甲基化变化，可以揭示发育/衰老的分子机制。

此外，DNA甲基化还与干细胞的自我更新和分化密切相关。通过研究干细胞中的DNA 甲基化状态，探究干细胞治疗机制。

③进化生物学研究

DNA甲基化在物种进化过程中也起着重要作用。比较不同物种之间的DNA甲基化模式，可以了解物种的进化关系和适应性进化机制。

案例1：9月新研究速递Nat Cell Biol：DNA甲基化+ChIP揭示TET2影响白血病增殖

主要内容：本研究确立了TET2凝聚在协调精确的DNA去甲基化和基因转录以支持肿瘤细胞生长中的关键作用。WGBS甲基化测序分析表明，在表达TET2CDΔLCI的MOLM-13细胞中，全基因组DNA甲基化水平随时间进展而降低，这与mESCs中TET2凝聚功能的丧失导致的广泛非特异性DNA去甲基化现象一致。
TET2CDΔLCI介导的DNA低甲基化在转录层面上引起了基因表达的变化，特别是与细胞死亡、应激反应和细胞分化相关的基因表达发生上调，并通过转录组测序得到了验证。

随后再TCGA白血病AML数据集与本次转录组数据进行相关性分析，发现趋势一致、

随即作者这这一堆基因中鉴定出15个预后标志物，能够预测AML的总生存率。

这些发现表明，TET2凝聚功能的丧失导致的全基因组DNA去甲基化可能会引起基因组三维结构的重组，改变转录水平，并可能对AML患者的临床结果产生影响

案例2：新研究速递New Phytol：DNA甲基化与转录组联合揭示四倍体小麦根系优势性状改变

主要内容：本文对两个二倍体小麦品种（SS和AA）及其合成的异源四倍体小麦品系（SSAA）进行了转录组和DNA甲基化测序的联合分析，后者在四倍体化后显示出根毛伸长和硝酸盐吸收与同化能力的改善。在SSAA四倍体的根部观察到全基因组层面的整体DNA甲基化水平出现普遍下降，亚基因组间的差异减少。DNA甲基化在第一外显子的变化与四倍体化过程中的转录改变表现出强烈的相关性。特异同源基因的转录与由同源序列变异塑造的偏向性DNA甲基化相关。转录因子MYB的结合位点主要在启动子附近且维持低甲基化水平，这可能从基因转录层面影响根毛生长。而两个根毛伸长的主调控因子，AlCPC和TuRSL4呈现转录水平的上调趋势，并伴随着启动子的低甲基化，这可能有助于根毛的伸长。硝酸盐转运基因表达出现上调，包括NPFs和NRTs，也与启动子的低甲基化显著相关，表明在提高氮利用效率方面存在表观遗传整合的调控方式。

转录组、甲基化测序数据二者关联，主要分为：

①转录组数据与甲基化测序数据依据基因获得关联关系；

②以基因作为桥梁，整合两组学关联数据。

DNA甲基化与基因表达之间存在复杂的调控关系，将基因表达与DNA甲基化进行关联分析可以进一步了解样本中DNA甲基化修饰和RNA表达是否存在整体上的相关性；以及样本中哪些基因的转录表达受到了DNA甲基化修饰的影响，受甲基化调控基因进而影响下游功能。

案例3：缺氧引起的胎儿心脏疾病中DNA甲基化和转录组的影响

主要内容：

甲基化数据显示，以转录起始位点（TSS）为中心的CpG甲基化急剧下降。与基因体内的CGI和CGS相比，TSS上游10 kb内的CpG岛（CGI）和CpG岛（CGS）被低甲基化。结合转录组数据表明TSS周围的基因表达与CpG甲基化之间存在负相关。值得注意的是，产前缺氧在胎儿和成人心脏中诱导甲基化模式呈相反变化，胎儿高甲基化、成人低甲基化。成年后心脏中基因表达模式的变化存在显著的性别性差异。通路分析表明，成年男性心脏中炎症相关通路的富集明显大于女性心脏。

单细胞+表观组学有2条研究方向：

①已知某种表观因子情况下直接在单细胞测序结果中寻找特异细胞亚群;

②对单细胞测序结果进行盲筛，根据筛选到的表观因子再决定后续细胞亚群研究方向;

案例4：DNA甲基化结合单细胞挖掘PSMB9在黑色素肿瘤抑制机制

主要内容：者使用已发表的免疫治疗队列进行了ScRNA-seq。共7186个细胞被分为9类(CD8+T细胞、CD4T细胞、B细胞、巨噬细胞、恶性细胞、恶性细胞2、树突状细胞、癌症相关成纤维细胞、自然杀伤细胞)通过各细胞类型PSMB9表达水平鉴定PSMB9高、低表达组。DEG显示PSMB9的高表达伴随着免疫基因的激活。GSEA显示IFN-g反应，通过NF-kB激活TNFa，抑制MYC靶点通路显著上调。 细胞相互作用分析检测T细胞对恶性细胞的杀伤和排斥。利用NicheNet，可以比较不同细胞组与免疫细胞相互作用的活性。结果表明，与PSMB9低水平组相比，IFNG是最活跃的配体，它们主要由CD8+T细胞和树突状细胞分泌。

案例5：通过DNA甲基化队列数据预测肝癌复发

主要内容：通过机器学习算法选出的46个cpg， 将SCAND3 、SGIP1和PI3作为训练阶段的候选预测因子。在这三个cpG的基础上，开发了E-HCC的甲基化标签(MSEH)，用于在训练队列中将患者分为高危复发组和低危复发组。由MSEH、肿瘤分化程度、肝硬化、乙型肝炎病毒表面抗原和抗病毒治疗组成在训练组中预测5年无复发生存率，在3个验证组中均表现良好。

本文作者用甲基化芯片筛选差异CpGs，并使用了两种机器学习算法筛选队列中显著差异CpG位点，使用回归模型筛选到3个候选位点，并验证MESH可以将E-HCC分为高或低复发风险组，可能对患者的个体化随访和治疗策略具有临床意义。

   经过以上的案例分享您是否已经对DNA甲基化研究思路有了初步了解，探索DNA甲基化在动物发育过程中基因组位置分布以及其在生命周期和疾病中的作用辅以多组学数据结合验证是甲基化研究过程中较为常见的研究方向。除此之外还有其他广泛的应用场景例如：基因调控和异染色质维持中的负面作用、DNA甲基转移酶(DNMTs)对转座子沉默、X染色体失活和印记基因调控机制、特定阅读蛋白识别导致信号传导抑制尤其是在启动子和调控区域的作用等等，以上种种揭示了调控网络的广泛交叉作用，并显著扩展了对基因组调控的理解。随着测序技术的不断发展以及研究的深入，对于DNA甲基化调控机制的探索将愈发精细。

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