蛋白质组学研究可以从整体水平观察样本内蛋白质的组成及其变化规律，整体性、概括性地了解生命体在某一生理状态下的蛋白表达、修饰、相互作用等，从而揭示蛋白功能，为生命科学的理论研究提供重要的参考意义。过去的几十年，随着质谱平台、蛋白质谱检测技术、数据分析方法等不断发展、完善，已形成了多种广泛应用的蛋白组学检测方法。目前最主流的定量蛋白质组学方法有3种：TMT、LabelFree和DIA。那很多老师又有疑问了，什么是4D蛋白质组学？还有现在大家在做的Astral-DIA又是什么，为什么能够横空出世得到大家的青睐？这里将逐一为您解惑。
首先给大家详细的大家介绍TMT、LabelFree和DIA：
TMT（Tandem Mass Tag）技术由美国Thermo Fisher Scientific开发的一种多肽体外标记技术，可使用6标(TMTsixplex™ Isobaric Label Reagent Set）、10标(TMT10plex™ Isobaric Label Reagent Set ）、16标（TMTpro 16plex）和18标（TMTpro 18plex）同位素标签对不同样本肽段进行标记，后续分组分进行检测（所以最终原始数据对应的是每个组分，并非每个样本）。一次实验可获得最多18个样本中蛋白质的相对含量。
TMT试剂主要由3部分组成：报告基团、平衡基团和肽反应基团。以6标试剂为例：报告基团相对分子质量分别为126、127、128、129、130和131；平衡基团相对分子质量分别为103、102、101、100、99和98，这样就形成了6种相对分子质量均为229的等量异位标签。
图1 TMT标签结构图
TMT标签试剂通过肽反应基团与肽段上赖氨酸及N端氨基酸残基相连。被标记肽段经过色谱分离后直接进入串联质谱仪中进行定性及定量检测。一级质谱中，任何一种TMT试剂标记的不同样品中的同一肽段表现出相同的质荷比；二级质谱中，报告基团、平衡基团、连接基团之间的化学键断裂释放出TMT报告基团和平衡基团。平衡基团发生中性丢失，报告基团被质谱仪检测并记录，在质谱低质量区产生了6个TMT报告离子峰，其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息，另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息;这些质谱原始数据经过数据库检索，可得到蛋白质的定性和相对定量信息。
图2 TMT项目检测流程图
Label-free采用非标签标记定量策略，每个样本回收肽段直接上机检测，通过比较质谱分析次数或质谱峰强度（常用方法），分析不同样品蛋白的变化。由于采用DDA（Data-dependent Acquisition）数据依赖性采集模式，只会对topN的母离子进行碎裂和MS2检测，所以结果中缺失值较多。
图3 LabelFree项目检测流程
DIA（Data-independent Acquisition）数据非依赖性采集模式将整个扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息；相较于DDA模式（TMT和LabelFree）蛋白覆盖率更高，定量更准确；且通过加入内标肽段iRT进行保留时间校正。传统DIA会结合DDA文库（使用本项目混合样本分若干组分）进行搜库分析，随着分析方法更新，不建库只检测项目样本进行直接分析的direct-DIA方法逐渐开始替代传统方法。
图4 DIA项目检测流程
图5 TMT、LabelFree和DIA方法比较汇总
4D蛋白组指的是用4D质谱平台（目前主要是布鲁克timsTOF系列）进行蛋白的蛋白组学检测服务。原理上4D蛋白组在传统保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）的基础之上增加了第四维的离子淌度（mobility；又称离子迁移率）的分离。相比传统3D平台，4D平台离子利用率和准确度更高，能以更少的上样量，实现高灵敏度、高通量、高精确度的蛋白检测。
图6 4D蛋白组学原理
那什么又是Astral-DIA 蛋白质组呢？Astral-DIA指的是使用赛默飞的Orbitrap Astral平台进行检测的DIA蛋白质组。该平台是赛默飞在2023推出的高分辨质谱新平台，结合了Quadrupole（四级杆）、Orbitrap（轨道阱）和全新的Astral（Asymmetric Ion Mirrors，非对称轨道无损质量检测器），使其能兼具超快的扫描速度，检测的灵敏度，蛋白组覆盖度，超高的通量以及精准定量性。
图7 Orbitrap Astral质谱仪内部结构
官方的测试中Orbitrap Astral在180 SPD（8min）通量下，可以实现超过8000个protein group深度的检测，而60SPD（24min）的情况下能实现10000+的深度。我们在在常见细胞和一些疑难样本进行了测试，结果呈现出类似的检出深度和重复性。
图8 Orbitrap Astral测试结果
我们联川生物作为国内第一批提供Astral-DIA蛋白组检测服务的公司，目前已进行上万例样本检测，近期我们对部分既往项目的蛋白覆盖度进行了统计，并和常规3D和4D平台项目结果进行比较，结果发现Astal-DIA能在更短机时（一般180SPD，8min）情况下检出比其他方法和平台更长机时更多的蛋白数，且在诸多的项目中保持很好的稳定性。
图9 Astral-DIA与其他蛋白产品覆盖度比较
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